16008.枯草芽孢桿菌基因組最小化的初步研究

1、枯草芽孢桿菌基因組最小化的初步研究枯草芽孢桿菌基因組最小化的初步研究PreliminarystudyongenomereductioninBacillussubtilis（國家自然科學基金面上項目資助NSFC21176182）（國家973計劃項目資助2011CBA008042012CB725203）學科專業(yè)：生物化工研究生：張雪玉指導教師：陳濤副教授天津大學化工學院二零一三年六月摘要本論文通過無痕基因刪除操作獲得基因組簡化的枯草芽孢桿菌

2、，以此作為平臺菌株，考察其核黃素的合成能力的變化?？莶菅挎邨U菌野生株Bacillussubtilis168中引入突變的ribC基因，得到可以合成少量核黃素的B.subtilis168RibC菌株，刪除突變菌株的upp基因得到B.subtilis168RibCΔupp菌株，以此為出發(fā)菌株進行基因組簡化的研究。根據已有文獻的報道，確定備選敲除區(qū)域。本文共刪除了包括類似原噬菌體的區(qū)域skin及prophage3、負責編碼合成聚酮類次生代謝產物

3、的pks操縱子、原噬菌體SPβ在內的的四個區(qū)域，最終得到了基因組簡化223.199Kb的BSZ10菌株，敲除的片段大小約占整個基因組大小的5.3%。研究采用基于upp基因作為負篩選標記的方法進行敲除。以實驗室前期構建的pCU質粒作為基礎操作質粒，通過插入待敲除區(qū)域的上下游同源臂構建敲除質粒，通過Spizizen轉化將敲除質粒導入宿主菌感受態(tài)細胞中。通過兩次單交換得到目的敲除菌株或恢復型菌株。兩次單交換分別是：第一次是敲除質粒與宿主染色體

4、同源區(qū)之間的單交換，敲除質粒整合到宿主菌染色體上形成整合子；第二次是整合子分子內同源區(qū)之間的同源重組。得到的菌株通過在5FU基本鹽培養(yǎng)基平板和氯霉素LB平板上點板驗證，得到的5FU抗性菌株且氯霉素敏感菌株即正確的敲除菌株。還可進一步通過菌落PCR驗證目的片段的敲除。將得到的簡化程度不同的菌株進行搖瓶發(fā)酵，考察核黃素的合成能力以及菌株的生長情況。共選取了四株基因組簡化菌株進行發(fā)酵，分別是BSZ5菌株（敲除Pks區(qū)的菌株，基因組減小了74.

5、837Kb）、BSZ7菌株（Skin區(qū)和Pks區(qū)共敲除的菌株，敲除片段大小為121.399Kb）、BSZ8菌株（敲除了Skin區(qū)、Pks區(qū)和Pro3區(qū)，基因組減小了132.199Kb）和BSZ10菌株（敲除了Skin區(qū)、Pks區(qū)和Pro3區(qū)以及部分SPβ區(qū)，基因組減小了223.199Kb）。通過實驗發(fā)現與出發(fā)菌株相比基因組簡化程度各不相同的菌株生長速率變化不大，最大OD高于出發(fā)菌株，葡萄糖的消耗速率有所提高，核黃素的合成能力并未受到影響