姜黃素、丹參、苦參堿對(duì)增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變的防治效果比較及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是以玻璃體和視網(wǎng)膜前后表面形成纖維增殖膜,由于膜的收縮和牽拉引起視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment,RD)為特征的一類眼病。該病常見于裂孔源性視網(wǎng)膜脫離后,是視網(wǎng)膜脫離手術(shù)失敗的主要原因,也是嚴(yán)重眼外傷、血管性和炎癥性視網(wǎng)膜病變的常見并發(fā)癥。視網(wǎng)膜色素上皮(retinalpigment epithelium,RPE)細(xì)胞作為最關(guān)

2、鍵細(xì)胞,貫穿于PVR發(fā)生、發(fā)展的所有過(guò)程。PVR病理上分為炎癥期、增殖期和瘢痕期三個(gè)階段。第一階段RPE細(xì)胞等移行至視網(wǎng)膜前和視網(wǎng)膜下,開始增殖;第二階段包括RPE細(xì)胞等大量增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的形成;最后階段纖維增殖膜形成并收縮導(dǎo)致RD。PVR炎癥期作為起始階段,對(duì)PVR的發(fā)生起決定性作用。此階段,由于血-視網(wǎng)膜屏障破壞,多種細(xì)胞因子釋放,其中白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)作為重要炎癥因子,可以刺激RPE細(xì)胞

3、分泌其他炎癥因子、粘附因子等,這些因素共同促進(jìn)RPE細(xì)胞移行、分化、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的形成。因此,本研究將IL-1β作為刺激因子,用于體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞和體內(nèi)造模、用藥實(shí)驗(yàn),更接近PVR早期病理過(guò)程。
　　 臨床上一直沿用的治療PVR的方法是玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù),手術(shù)技術(shù)的飛速發(fā)展提高了視網(wǎng)膜復(fù)位率,但術(shù)后往往由于再次增殖導(dǎo)致RD復(fù)發(fā),嚴(yán)重影響患者視力預(yù)后。因此,選擇安全有效的藥物早期防治PVR是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。迄今為止眼科界

4、所研究用于PVR的西藥不下幾十種,西藥雖然抗增殖作用強(qiáng)大,但作用單一,且可能存在一定細(xì)胞毒性,一直未能應(yīng)用于臨床。中藥具有藥源豐富、作用廣泛且毒副作用小等多種優(yōu)點(diǎn),進(jìn)入我們的視線。三種從植物中提取的天然中藥姜黃素、丹參、苦參堿具有抗氧化、抗炎、抗增殖、抗微生物等多種功效,在內(nèi)科疾病中研究較多,眼科領(lǐng)域國(guó)內(nèi)外報(bào)道為數(shù)不多。因此,本課題分別通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)用藥實(shí)驗(yàn)研究這三種中藥在PVR防治中的作用效果及相關(guān)機(jī)制,為PVR防治提供新思路

5、。
　　 第一部分姜黃素、丹參、苦參堿抑制IL-1β引起的兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:研究不同劑量IL-1β對(duì)體外培養(yǎng)的兔RPE細(xì)胞增殖的影響及姜黃素、丹參、苦參堿對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的PVR細(xì)胞增殖的抑制作用,評(píng)價(jià)IL-1β在RPE細(xì)胞增殖中的作用以及三種藥物的抗增殖效果與差異。
　　 方法:采用胰蛋白酶消化法體外分離、培養(yǎng)有色兔RPE細(xì)胞,以免疫細(xì)胞化學(xué)法和透射電鏡進(jìn)行細(xì)胞鑒定。取第4代生

6、長(zhǎng)狀態(tài)良好的RPE細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。以MTT法檢測(cè)不同濃度IL-1β(2.5、5、10、20μg/L)作用24、48、72h后對(duì)RPE細(xì)胞增殖的影響。選擇最佳IL-1β作用濃度,以MTT法檢測(cè)24、48、72h后姜黃素(5、10、20μg/ml)、丹參(5、10、20μg/ml)、苦參堿(100、200、400μg/ml)對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞增殖的抑制作用。相關(guān)回歸分析計(jì)算各藥物各時(shí)間點(diǎn)半數(shù)抑制率(IC50)劑量。
　　 結(jié)

7、論:通過(guò)體外培養(yǎng)的方法可獲得大量兔RPE細(xì)胞,用于體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究;IL-1β可促進(jìn)RPE細(xì)胞增殖,濃度為10μ/L時(shí)作用最顯著;姜黃素、丹參、苦參堿均可抑制IL-1β引起的:RPE細(xì)胞增殖,且各藥抑制作用均呈時(shí)間和劑量依賴性,三藥抗增殖作用由強(qiáng)到弱依次為:姜黃素、丹參、苦參堿。
　　 第二部分姜黃素對(duì)IL-1β介導(dǎo)的兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中NF-κB相關(guān)通路的影響
　　 目的:通過(guò)觀察姜黃素對(duì)IL-1β引起的兔RPE細(xì)

8、胞移行的影響,應(yīng)用Western blot法、RT-PCR法、免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)姜黃素對(duì)IL-1β作用下兔RPE細(xì)胞中NF-κBp65、IκB-α、COX-2蛋白和mRNA表達(dá)的影響,探討姜黃素的抗炎效果及作用機(jī)制。
　　 方法:選取第4代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的兔RPE細(xì)胞用于本研究。細(xì)胞移行研究中,通過(guò)制作細(xì)胞損傷模型,計(jì)算進(jìn)入損傷區(qū)的細(xì)胞數(shù),研究IL-1β(10μg/L)對(duì)RPE細(xì)胞移行能力的影響及姜黃素(10μg/ml)對(duì)IL

9、-1β作用下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移行的抑制作用。
　　 COX-2:Western blot和RT-PCR法檢測(cè)不同濃度IL-1β(0.1、1、10μg/L)作用24h后RPE細(xì)胞中蛋白和mRNA的表達(dá)情況;不同時(shí)間段姜黃素(10μg/m1)對(duì)IL-1β(1μg/L)作用下RPE細(xì)胞中蛋白和mRNA的表達(dá)的影響。NF-κBp65、IκB-α:Western blot法檢測(cè)不同時(shí)間段姜黃素(10μg/ml)對(duì)IL-1β(1μg/L)

10、作用下RPE細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響。免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)curcumin(10μg/ml)對(duì)IL-1β(10μg/L)作用下RPE細(xì)胞NF-κBp65、IκB-α、和COX-2表達(dá)的影響。
　　 結(jié)論:姜黃素可以顯著抑制IL-1β引起的兔RPE細(xì)胞移行;IL-1β可激活NF-κB信號(hào)通路刺激細(xì)胞表達(dá)COX-2,姜黃素可以通過(guò)阻斷這一途徑從而抑制炎癥因子的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。
　　 第三部分姜黃素、丹參及苦參堿防治兔眼增殖性

11、玻璃體視網(wǎng)膜病變的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:觀察和對(duì)比兩種方法建立PVR模型的造模效果,為防治PVR研究尋找最適宜造模方法,進(jìn)一步研究三種中藥對(duì)PVR的防治效果及差異。
　　 方法:篩選正常有色兔36只,72眼用于PVR造模和藥物實(shí)驗(yàn)。先進(jìn)行兔眼內(nèi)PVR模型的建立:36眼隨機(jī)分為3組,每組12眼,對(duì)照組玻璃體注射生理鹽水0.1ml,造模組平均分為兩組,一組玻璃體內(nèi)注射RPE細(xì)胞2×106個(gè),0.1ml,另一組玻璃體內(nèi)注射

12、RPE細(xì)胞2×106個(gè)與IL-1β250U混合液共0.1ml。再進(jìn)行體內(nèi)藥物實(shí)驗(yàn):從上述造模方法中選出較好者用于此實(shí)驗(yàn),用藥組每組12眼,造模同時(shí)分別注入姜黃素、丹參和苦參堿。術(shù)后1、3、7、14、21、28d進(jìn)行裂隙燈顯微鏡觀察眼前節(jié)及玻璃體情況,間接眼底鏡、眼底彩色照相和B超觀察玻璃體混濁程度及視網(wǎng)膜脫離情況。分別對(duì)玻璃體混濁程度和PVR嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)。
　　 結(jié)論:玻璃體注射RPE細(xì)胞聯(lián)合IL-1β建立兔眼實(shí)驗(yàn)性PVR模