Wnt信號通路在小鼠內(nèi)耳中的表達(dá)及對具有干-祖細(xì)胞樣細(xì)胞特性的Wnt反應(yīng)細(xì)胞的調(diào)控.pdf

1、本研究共分為三部分。
　　第一部分 小鼠內(nèi)耳Wnt信號的基因表達(dá)研究
　　目的:Wnt信號通道可調(diào)控干細(xì)胞的自我更新和分化。目前研究表明，Wnt信號通路可調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，胃腸道系統(tǒng)，心臟系統(tǒng)，骨骼系統(tǒng)，乳腺干細(xì)胞，皮膚干細(xì)胞，造血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞以及其他系統(tǒng)器官干細(xì)胞功能。為了解經(jīng)典Wnt信號通道在調(diào)控內(nèi)耳毛細(xì)胞再生中所起的作用，本章先檢測Wnt信號通道下游靶基因Axin2在小鼠內(nèi)耳的表達(dá)，為進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。

2、　　方法:通過利用野生型和作為經(jīng)典Wnt信號通道激活表現(xiàn)模型的雜合子Axin2-LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠，1.以新生和成年小鼠作為研究對象，無菌條件下取出聽泡，X-gal染色后行冰凍切片，以觀察Axin2基因在內(nèi)耳中表達(dá)的部位及表達(dá)部位的細(xì)胞種類，或者直接做冰凍切片，用各種不同細(xì)胞標(biāo)志物（毛細(xì)胞，支持細(xì)胞，上皮細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞，增殖細(xì)胞）行免疫組化染色以鑒定細(xì)胞表型。2.分別在野生型小鼠出生1天(P1)、P7、P21、P28體內(nèi)注射Edu(50

3、mg/kg)，2天后取出聽泡冰凍切片或者整個(gè)橢圓囊觀察Edu陽性細(xì)胞位置和數(shù)目以了解耳蝸內(nèi)具自我增殖潛力的細(xì)胞種類和不同年齡的增殖能力。3.分別取出耳蝸和橢圓囊，以X-gal染色，或行RT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，以觀察Axin2基因表達(dá)隨年齡的變化。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Wnt信號在新生小鼠耳蝸中基底膜以下的Tympanic border cells(TBCs)中表達(dá)，TBCs不表達(dá)成熟上皮細(xì)胞，毛細(xì)胞和支持細(xì)胞標(biāo)志。在新生小鼠

4、有活躍增殖細(xì)胞標(biāo)志，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志。Wnt信號表達(dá)與增殖能力一致隨年齡迅速下降，出生3周后消失。而在前庭器官橢圓囊中，Wnt信號在間質(zhì)細(xì)胞(stromal cells)中表達(dá)，具有間質(zhì)細(xì)胞，和增殖細(xì)胞標(biāo)志并隨年齡增大，Axin2基因表達(dá)水平和細(xì)胞增殖能力下降緩慢，但在成年小鼠中仍有表達(dá)。
　　結(jié)論:Wnt信號在小鼠耳蝸TBCs，橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。與在新生小鼠耳蝸中表達(dá)相比，成年小鼠橢圓囊中Wnt信號持續(xù)存在。目前研究已經(jīng)證實(shí)

5、成年小鼠橢圓囊可再生毛細(xì)胞，提示W(wǎng)nt信號的表達(dá)對毛細(xì)胞再生有著重要的意義。
　　第二部分 新生小鼠耳蝸Axin2表達(dá)細(xì)胞自我增殖和分化功能及Wnt信號通道對其調(diào)控的研究
　　目的:在哺乳動物耳蝸中，毛細(xì)胞僅在胚胎時(shí)期和新生小鼠中具有非常有限的再生能力。在耳蝸內(nèi)尋找有干細(xì)胞潛能的細(xì)胞從而替代失去的毛細(xì)胞，恢復(fù)聽力損失迫在眉睫。我們通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，研究新生小鼠耳蝸Wnt信號表達(dá)細(xì)胞TBCs的自我增殖和分化功能，及Wnt信號

6、通道對其的調(diào)控作用。
　　方法:通過利用雜合子Axin2-LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠，1.無菌條件下取40-50只P0-P3 Axin2lacZ/+小鼠耳蝸，通過β-galatosidase，3-carboxyumbeliferylβ-D-galactopyranoside的酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)將Axin2高表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記上CasBlue染料，再通過流式細(xì)胞儀鑒定分離Axin2高表達(dá)細(xì)胞和低表達(dá)細(xì)胞，以RT-PCR，q-PCR確定A

7、xin2基因在分離后的高表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞中的表達(dá)。2.將分離出的細(xì)胞分別在體外無血清非粘附的含生長因子EGF，IGF-1，bFGF，and heparin sulfate的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，5天后比較Axin2高表達(dá)細(xì)胞和低表達(dá)細(xì)胞形成的克隆球以觀察自我增殖能力。將分離出的細(xì)胞在完全培養(yǎng)液和飼養(yǎng)細(xì)胞條件下體外培養(yǎng)10天后用毛細(xì)胞，支持細(xì)胞，增殖細(xì)胞標(biāo)志行免疫組化染色以鑒定細(xì)胞的分化及分化細(xì)胞的表型。3.無菌條件下取P3野生型小鼠耳蝸于完

8、全培養(yǎng)基中，分別加入純化的Wnt信號通道的激動劑Wnt3a(200ng/ml)，R-spondin1(1ug/ml)和抑制劑Fz8CRD(25ug/ml)體外培養(yǎng)3-5天，最后12小時(shí)于培養(yǎng)基中加入Edu（25ng/ml），免疫組化實(shí)驗(yàn)觀察Wnt對耳蝸細(xì)胞自我增殖的作用。與增殖能力相一致，在Wnt信號通道激動劑和抑制劑培養(yǎng)3天后行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)觀察Axin2的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:通過流式細(xì)胞術(shù)分離的耳蝸內(nèi)Axin2高表達(dá)細(xì)胞在

9、體外培養(yǎng)中形成上皮細(xì)胞島的數(shù)目是Axin2低表達(dá)細(xì)胞的3倍，并且其細(xì)胞島內(nèi)的增殖標(biāo)志陽性細(xì)胞較低表達(dá)細(xì)胞明顯活躍表達(dá)。同時(shí)Axin2高表達(dá)細(xì)胞可分化為新生的有毛細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志和支持細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志的細(xì)胞。而酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)顯示W(wǎng)nt信號通道激活劑和抑制劑可增加或減少β-galatosidase在新生小鼠耳蝸中的表達(dá)。且Wnt3a，R-spondin1可使TBCs區(qū)域的Edu陽性細(xì)胞數(shù)目為對照組的2倍，F(xiàn)z8CRD則使之減少至對照組的1/2。<

10、br>　　結(jié)論:新生小鼠耳蝸中Wnt信號的表達(dá)細(xì)胞-TBCs，具有自我增殖和分化的能力，提示TBCs具有干/祖細(xì)胞的特性，并且為Wnt信號通路所調(diào)控。
　　第三部分 小鼠橢圓囊Axin2表達(dá)細(xì)胞增殖分化功能及Wnt信號通道對其調(diào)控的研究
　　目的:目前已經(jīng)證實(shí)，在成年哺乳動物中區(qū)別于耳蝸，前庭器官毛細(xì)胞仍然有再生能力，并存在有干細(xì)胞潛能的細(xì)胞。我們通過對橢圓囊中Wnt信號表達(dá)細(xì)胞的研究，以探索Wnt信號通路在新生和成年小鼠橢

11、圓囊中對其增殖分化的調(diào)控。
　　方法:通過利用野生型小鼠，雜合子Axin2-LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠和Axin2-cre雜交mTmG(membrane-Tdtomato-membrane-GFP)小鼠，1.無菌條件下取P3和P30 Axin2LacZ/+小鼠橢圓囊，分別加入Rspondin-1(1ug/ml)，F(xiàn)z8CRD(25ug/ml)在完全培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)3天，通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)觀察β-galatosidase濃度和q-PCR實(shí)

12、驗(yàn)觀察Axin2基因表達(dá)水平，以了解Wnt信號通路激動劑和抑制劑在內(nèi)耳橢圓囊中的作用。2.上述條件體外培養(yǎng)橢圓囊，在最后12小時(shí)于培養(yǎng)基中加入Edu（25ng/ml），免疫染色實(shí)驗(yàn)觀察Wnt信號對橢圓囊細(xì)胞自我增殖的影響。3.體內(nèi)譜系追蹤Axin2表達(dá)細(xì)胞。通過利用Axin2-Cre小鼠與mTmG(membrane-Tdtomato-membrane-GFP)小鼠的雜交后代，cre-loxp重組酶系統(tǒng)在沒有激活的情況下所有細(xì)胞為紅色，表

13、達(dá)Tdtomato。在新生和成年小鼠中注射枸櫞酸他莫昔芬(4mg/25g)激活Cre-loxp系統(tǒng)后，所有的Axin2表達(dá)細(xì)胞被激活，其中GFP基因代替Tdtomato表達(dá)，僅在Axin2陽性細(xì)胞中表達(dá)GFP的綠色信號。P3小鼠注射他莫昔芬32天后，成年小鼠50天后取出小鼠聽泡，冰凍切片后免疫組織化學(xué)染色，譜系追蹤Axin2表達(dá)細(xì)胞，以觀察Axin2表達(dá)細(xì)胞是否具有干細(xì)胞/祖細(xì)胞特性。
　　結(jié)果:體外完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)P3和P30小

14、鼠橢圓囊發(fā)現(xiàn)均有明顯的增殖能力。在P3小鼠中增殖細(xì)胞平均分布在橢圓囊中，P30小鼠中增殖細(xì)胞僅僅在strialor區(qū)域表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附和q-PCR實(shí)驗(yàn)均顯示W(wǎng)nt信號通道激活劑R-spondin1和抑制劑Fz8CRD可調(diào)節(jié)β-galatosidase及Axin2基因在新生和成年小鼠中的表達(dá)。經(jīng)加入R-spondin1和Fz8CRD體外培養(yǎng)橢圓囊可以明顯增加和減少其增殖能力，說明其增殖為Wnt系統(tǒng)調(diào)控。通過譜系追蹤Axin2陽性細(xì)胞，追