兩種新的FSHR基因mRNA選擇性剪切體的鑒定及功能的初步研究.pdf

1、研究背景:
　　 近期有研究發(fā)現(xiàn)在一些實體瘤如肺癌，前列腺癌，乳腺癌等腫瘤周圍血管內(nèi)皮有促卵泡素受體(follicle-stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)的表達，這提示著FSHR可能參與了血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等因子介導(dǎo)的腫瘤血管生成的過程。促卵泡素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)及其

2、受體還在卵巢癌和前列腺癌的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)FSH可以作用于FSHR參與多條信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，還可以通過上調(diào)上皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR），VEGF等蛋白的表達量，進而參與細胞的增生、侵襲、遷移及腫瘤血管生成的過程。
　　 FSHR屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，該基因是在鼠睪丸首次克隆發(fā)現(xiàn)。生理條件下，F(xiàn)SHR特異性表達于睪丸支持細胞和卵巢顆粒細胞中，少數(shù)

3、表達于性腺的血管內(nèi)皮細胞。迄今為止，研究者們已在許多物種上發(fā)現(xiàn)多種FSHR的變異體。在綿羊和鼠的性腺上發(fā)現(xiàn)pre-mRNA通過選擇性剪切產(chǎn)生了至少4種FSHR亞型(FSHR1～4)，這些亞型的氨基端相同，而羧基端不同。這些由同一基因產(chǎn)生的不同受體因其不同的空間結(jié)構(gòu)可以表現(xiàn)為主導(dǎo)正性，主導(dǎo)負性，生長因子型和可溶性結(jié)合蛋白的特征。有學(xué)者認為FSHR基因的多態(tài)性可能與卵巢對FSH的反應(yīng)性有關(guān)，也有研究者發(fā)現(xiàn)一些FSHR剪切體可以顯著降低cAM

4、P的活化，且在不孕人群中占相當高的比例。
　　 選擇性剪切是真核細胞一種重要的mRNA轉(zhuǎn)錄后加工機制，由此而產(chǎn)生相應(yīng)的多種mRNA異構(gòu)體，使一個基因可以翻譯為多種多肽序列，是基因表達多樣性的重要表達形式。對人類基因組分析表明，目前60％的基因在表達過程中可通過選擇性剪切，產(chǎn)生多種形式的mRNA，一種基因甚至可以產(chǎn)生上萬種不同形式的mRNA。不同的選擇性剪切與細胞生理、發(fā)育調(diào)節(jié)以及腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，研究基因的選擇性剪切對

5、了解基因功能有著重要意義。
　　 本研究旨在對FSHR各種選擇性剪切體的鑒定及其相關(guān)功能進一步的探討，以期為深入了解和闡明該基因在女性生殖系統(tǒng)及一些惡性腫瘤中的表達調(diào)控研究提供重要的依據(jù)。
　　 研究目的:
　　 通過在人卵巢上皮組織上鑒定FSHR各種選擇性剪切體，檢測其在不同女性顆粒細胞及部分腫瘤細胞系的表達情況，構(gòu)建包含各剪切體的質(zhì)粒，研究其在調(diào)節(jié)細胞信號傳導(dǎo)通路的相關(guān)功能。
　　 研究方法:

6、　　 1.收集卵巢囊腫病人正常卵巢上皮組織樣本，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA.
　　 2.以卵巢上皮組織總RNA為模板，根據(jù)Genbank中FSHR序列設(shè)計特異性引物，經(jīng)3'RACE PCR擴增目的基因。
　　 3.實時定量PCR檢測各剪切體在不同女性顆粒細胞及部分腫瘤細胞系的表達情況。
　　 4.利用基因重組技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒。
　　 5.瞬時轉(zhuǎn)染人顆粒細胞癌細胞（KGN），Western Blot法檢

7、測各剪切體表達情況。
　　 6.免疫熒光法和Western Blot法檢測rhFSH處理不同剪切體轉(zhuǎn)染KGN后P-Akt、Akt、P-ERK1/2、ERK1/2、P-p38 MAPK的表達變化。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.經(jīng)3'RACE，序列比對發(fā)現(xiàn)兩種新的FSHR基因mRNA選擇性剪切體。
　　 提取人卵巢上皮組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)3'RACE PCR擴增出3條目的片段。野生型FSHR(hFSHR

8、-1，R1)全長約1700bps。與之相比，hFSHR-2(R2)缺失了第十個外顯子并獲得了一段額外的序列，而hFSHR-3(R3)僅由前六個外顯子組成。
　　 2.各個剪切體在不同女性顆粒細胞樣本及部分腫瘤細胞系中表達情況。
　　 收集30例接受(I)(V)F女性的顆粒細胞樣本，實時定量PCR發(fā)現(xiàn)其中13個樣本表達hFSHR-2，22個樣本表達hFSHR-3，只有9個樣本表達hFSHR-1。
　　 22種細胞系

9、中，19種細胞系表達hFSHR-2，1種細胞系表達hFSHR-3，3種細胞系表達hFSHR-1。
　　 3.經(jīng)酶切鑒定，測序成功構(gòu)建質(zhì)粒。
　　 構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1-HA-FSHR-2和pcDNA3.1-HA-FSHR-3，瞬時轉(zhuǎn)染KGN，Western Blot法檢測HA-FSHR融合蛋白表達。
　　 4.hFSHR-2和hFSHR-3可以抑制FSH介導(dǎo)的Akt、ERK1/2、p38 MAPK信號傳導(dǎo)通路

10、。
　　 Western Blot結(jié)果顯示:KGN表達hFSHR-1。10ng/ml rhFSH能以時間依賴性方式上調(diào)KGN的P-Akt、P-ERK1/2蛋白的表達水平。然而轉(zhuǎn)染R2或R3后均抑制FSH介導(dǎo)的Akt、ERK1/2、p38 MAPK的磷酸化水平。免疫熒光法結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染R2或R3后，P-ERK1/2抗體標記的熒光強度均低于未轉(zhuǎn)染組。
　　 結(jié)論:
　　 我們在人卵巢上皮上發(fā)現(xiàn)了2種新的FSHR mR