可血管注射用胰島素PELGE三嵌段共聚物納米給藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、以生物可降解聚合物為載體材料的納米給藥系統(tǒng)在控制藥物釋放和實現(xiàn)靶向給藥方面具有廣闊的應(yīng)用前景，但對于多肽和蛋白質(zhì)類藥物的血管內(nèi)注射給藥，必須要克服易于被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的快速清除，增加藥物在血中的循環(huán)時間等問題。本課題利用由親水性的柔性長鏈聚乙二醇單甲醚對乳酸／羥基乙酸共聚物進(jìn)行修飾合成的mPEG-PLGA-mPEG三嵌段共聚物為材料，以治療糖尿病的首選藥物胰島素作為多肽和蛋白質(zhì)類的模型藥物，研究了PELGE系列共聚物納米粒(INS-PEL

2、GE-NPs)的制備工藝、理化性質(zhì)、冷凍干燥工藝、體外釋藥特性、體內(nèi)藥效學(xué)和體外細(xì)胞毒性等，探討了三嵌段共聚物PELGE在多肽和蛋白質(zhì)類藥物的可血管注射用納米給藥系統(tǒng)中應(yīng)用的可能性，為多肽和蛋白質(zhì)類藥物的可血管注射用納米給藥系統(tǒng)的臨床應(yīng)用積累科學(xué)數(shù)據(jù)。 第一，通過對柱效、分離度和對稱因子等指標(biāo)的考察，優(yōu)化了測定INS-PELGE-NPs中INS包封率的色譜條件，建立了快速、可靠的測定方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。結(jié)果表明，該方法靈

3、敏度高，重現(xiàn)性好，方法簡便，對INS-PELGE-NPs中INS包封率的測定具有較高的選擇性和較佳的分離度，其酸性降解產(chǎn)物(A21-DI)和堿性降解產(chǎn)物(B3-DI)、多種輔料、有機(jī)溶劑等對INS的測定均無干擾，各有關(guān)物質(zhì)峰與INS峰均能達(dá)到完全分離，且峰形對稱。該測定方法還可用于考察INS的降解情況，用于納米粒制備工藝的優(yōu)化及穩(wěn)定性的研究，用于計算INS-PELGE-NPs的載藥量，用于考察納米粒膠體溶液中是否殘余有一定的有機(jī)溶劑，還

4、可用于考察INS在水溶液中發(fā)生聚合反應(yīng)的程度等。 第二，通過比較了四種不同的納米粒制備方法，確定了使用復(fù)乳／溶劑擴(kuò)散法制備INS-PELGE-NPs，詳細(xì)考察了以Pluronic F-68為表面活性劑的復(fù)乳／溶劑擴(kuò)散法制備納米粒的各工藝因素，得到了優(yōu)化的納米粒制備工藝，并在此基礎(chǔ)上探討了2種表面活性劑，即脫氧膽酸鈉和HX-69，應(yīng)用于蛋白質(zhì)類藥物納米給藥系統(tǒng)的可能性。試驗結(jié)果表明，以P1uronic F-68和HX-69為表面活

5、性劑所制得的納米粒，制備工藝穩(wěn)定，納米粒的粒徑約為120 nm～160 nm，包封率在93％以上：而以DOC為表面活性劑所制得的納米粒，粒徑約為70 nm，包封率在86％以上。另外，還利用優(yōu)化的制備工藝，考察了不同共聚物在以HX-69為表面活性劑所制得的納米粒的有關(guān)性質(zhì)，結(jié)果表明，該制備方法可應(yīng)用于PLGA及一系列的PELGE三嵌段共聚物納米粒的制備，并具有制備工藝穩(wěn)定，包封率高，粒徑分布均勻等特點(diǎn)。以上結(jié)果為本課題提出的DOC和HX-

6、69在蛋白質(zhì)類藥物納米給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用積累了科學(xué)數(shù)據(jù)。 第三，通過以凍干品的外觀、再分散性、形態(tài)、粒徑及其分布、Zeta電位、包封率、再分散指數(shù)和凍干品中藥物的保留率等為指標(biāo)，考察并優(yōu)化了以Pluronic F-68為表面活性劑所制得的INS-PELGE-NPs的冷凍干燥工藝。試驗結(jié)果表明，使用納米粒膠體溶液的濃度為2.0 mg·mL<'-1>，凍干保護(hù)劑的用量為7.5％(w／v)時，于中速預(yù)凍(-40℃，2 h：-60℃，1h

7、)條件下所得到的凍干品較佳，并以5.0％(w／v)蔗糖和2.5％(w／v)乳糖為混合凍干保護(hù)劑的冷凍干燥工藝最優(yōu)。同時，得到優(yōu)化的冷凍干燥工藝還可應(yīng)用于以DOC和HX-69為表面活性劑所制得的INS-PELGE-NPs膠體溶液。另外，根據(jù)納米給藥系統(tǒng)凍干工藝的特點(diǎn)所提出的以RI值和RE值作為冷凍干燥工藝的考察指標(biāo)，有利于優(yōu)化納米粒的冷凍干燥工藝，提高冷凍干燥品的質(zhì)量。 第四，通過考察納米粒的體外釋放試驗方法和不同表面活性劑和附加

8、劑的用量對納米粒體外釋放特性的影響，得到了具有一定緩釋性的納米粒制備工藝，并考察了不同聚合物的納米粒體外釋放特性，優(yōu)選出具有較好緩釋性的PELGE聚合物。試驗結(jié)果表明，選擇離心后取出全部釋放介質(zhì)再補(bǔ)充新鮮釋放介質(zhì)的完全漏槽法作為體外釋放試驗考察的方法較優(yōu)，確定了在PBSl(0.01 mol·L<'-1> PBS，pH7.4，0.15 mol·L<'-1> NaCl)的釋放介質(zhì)中，37℃，50 r·min<'-1>的振搖次數(shù)等條件下進(jìn)行

9、INSPELGE-NPs的體外釋放特性考察。通過考察不同用量的Pluronic F-68和HX-69為表面活性劑，甘油和zn<'2+>鹽為附加劑時對納米粒的初始釋放速率、累積釋放量的影響，結(jié)果表明，表面活性劑HX-69本身就具有一定的抑制藥物釋放的作用，ZnAc<,2>在Pluronic F-68和HX-69的表面活性劑中均具有較強(qiáng)的抑制藥物釋放的作用。當(dāng)HX-69的濃度為0.5％(w／v)時，加入1.0％(w／v)的ZnAc<,2>后

10、，對初始釋放階段快速釋藥的抑制效果較優(yōu)。通過考察不同比例和分子量的mPEG、不同比例的LA／GA、以及不同分子量的共聚物對IVS-PEL,GE-NPs體外釋放特性的影響，結(jié)果表明，PELGE的組成和比例相同時，納米粒的累積釋放量在一定范圍內(nèi)隨共聚物分子量的增加而增加，而初始釋放階段的釋放速率隨共聚物分子量的增加而減??；PELGE的組成相同，mPEG比例不同，且當(dāng)共聚物分子量相差較大時，累積釋放量隨共聚物分子量的增加而增加，而當(dāng)共聚物分子

11、量相近時，累積釋放量隨mPEG比例的增加而增加，但初始釋放階段的釋放速率通常隨共聚物分子量的增加而減??；當(dāng)PELGE的分子量相近時，累積釋放量隨LA／GA比例的增加而增加，而初始釋藥階段的釋放速率可能主要隨IJA／GA比例的增加而增加，還隨mPEG分子量的增加而增加。通過對不同共聚物的IVS-PELGE-NPs體外釋放特性的考察，結(jié)果得到了具有適宜緩釋性的PELGE聚合物納米粒，即：在0.5％(w／v)的HX-69表面活性劑中加入1.0

12、％(w／v)ZnAc<,2>的附加劑所制得的mPEG2k<,-15>-PLGA70／30-mPEG2k<,-15>-11k共聚物納米粒在初始釋放階段具有較低的釋放速率，且在48 h內(nèi)具有一定的累積釋放量。 第五，以鏈脲佐菌素(STZ)致糖尿病模型大鼠的血糖水平為指標(biāo)，考察了高、中、低3個劑量(20 IU-kg<'-1>、10 IU-kg<'-1>、5 IU-kg<'-1>)的INS-PELGE-NPs組和高劑量(20 IU-kg

13、<'-1>)的精蛋白鋅胰島素注射液(PZI)組降血糖作用的程度和持續(xù)的時間，結(jié)果表明，給予高、中、低3個劑量的INS-PELGE-NPs和高劑量的PZI均有較強(qiáng)的降血糖效果。對于20 IU-kg<'-1>劑量的PZI，在給藥2小時后就達(dá)到最大的血糖降低水平，并在給藥后8 h時血糖值就回升到給藥前的水平，而相同劑量的INS-PELGE-NPs在給藥4小時后，血糖降低程度最大，并在給藥后的16 h才慢慢回升到給藥前的血糖水平，且中、高劑量I

14、NS-PELGE-NPs的降血糖效果可持續(xù)12 h。 第六，通過以0.5％(w／v)的Pluronic F-68和O.5％(w／v)甘油制得PLGA納米粒為對照，使用MTT試驗法對以Pluronic F-68、DOC和HX-69為表面活性劑、以mPEG2k<,-15>-PLGA70／30-mPEG2k<,-15>-11k為共聚物所制備的空白PELGE-NPs膠體溶液進(jìn)行了體外細(xì)胞毒性的評價。結(jié)果表明，3種不同表面活性劑所制備的納

15、米粒隨共聚物濃度的增加，細(xì)胞存活率降低。其中，以Pluronic F-68為表面活性劑的納米粒，在濃度1.0 mg-mL<'-1>以下時對L929細(xì)胞無明顯毒性，而以O(shè).5％(w／v)DOC為表面活性劑、0.5％(’w／v)甘油為附加劑與以0.5％(w／v)HX-69為表面活性劑、1.0％(’w／v)ZnAc2為附加劑的mPEG2k<,-15>-PLGA70／30-mPEG2k<,-15>-11k納米粒，在濃度0.22mg-mL<'-1

16、>以上時具有一定的細(xì)胞毒性，其原因可能是表面活性劑DOC和HX-69具有一定的細(xì)胞毒性，但可通過對納米粒的進(jìn)一步純化和降低納米粒的濃度來降低細(xì)胞毒性。因此，以Pluronic F-68、DOC和HX-69為表面活性劑制備的PELGE-NPs在一定的濃度下具有可血管注射用的應(yīng)用前景。 總之，通過對以Pluronic F-68、DOC和HX-69為表面活性劑制備的INS-PELGE-NPs的系統(tǒng)考察，結(jié)果表明，上述3種PELGE