血吸蟲蟲卵蛋白IPSE基因合成、表達及功能分析.pdf

1、血吸蟲病是一種危害人類健康的重要的地方性傳染病。血吸蟲之所以能長期寄生于人體內(nèi)，主要的原因是血吸蟲成蟲和蟲卵的排泄分泌抗原能夠誘導宿主的免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫反應類型的偏移，由感染初期的具有抗血吸蟲感染功能的Th1型保護性免疫反應轉(zhuǎn)變?yōu)橛欣谘x生長發(fā)育的Th2型免疫反應。血吸蟲排泄分泌抗原來源于血吸蟲蟲體或蟲卵，與宿主免疫系統(tǒng)直接接觸，是活體血吸蟲存在于宿主體內(nèi)的直接證據(jù)，檢測這些蟲源性分子或針對這些分子的特異性抗體具有重要的診斷意義。同

2、時，研究這些分子的功能也將有助于闡明血吸蟲感染免疫機制，對于發(fā)展高效疫苗，免疫佐劑以及發(fā)展自身免疫性疾病的預防措施同樣具有重要的促進作用。 已有的研究表明曼氏血吸蟲的蟲卵蛋白IPSE(IL4-inducing principle of Smansonieggs)分子在蟲卵中含量豐富，是一種外分泌糖蛋白。以此抗原檢測血吸蟲病血清抗體，表現(xiàn)出高度的特異性和敏感性，具有較高的診斷價值和一定的療效考核價值。同時該分子還是一種有效的免疫調(diào)

3、節(jié)劑，能促進IL-4水平升高，增強Th2型免疫應答。對日本IPSE樣分子的研究尚未見報道，本研究根據(jù)曼氏血吸蟲的IPSE基因DNA序列，人工合成IPSE基因，制備了具有天然功能活性的重組IPSE蛋白，為未來采用cDNA文庫篩選的方法發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲IPSE樣蛋白分子基因，發(fā)展新的血吸蟲病診斷方法、免疫干預措施提供了條件。本研究包括如下三個部分內(nèi)容： 1.曼氏血吸蟲蟲卵IPSE基因合成與鑒定根據(jù)編碼IPSE成熟肽基因的核苷酸序列設(shè)計

4、14條末端互補的寡核苷酸片段(每條長50bp)，并進行化學合成。以此14條寡核苷酸片段為引物進行OverlappingPCR，獲得長度為417bp的IPSEDNA片段。將合成的DNA片段插入到TA克隆載體pGEM-T中后進行DNA序列分析。測序結(jié)果顯示合成的IPSE序列與天然基因序列完全一致，表明本研究的曼氏血吸蟲蟲卵IPSE基因合成獲得成功。 2.IPSE基因的原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及融合蛋白的表達將IPSEDNA片段定向克隆到表

5、達載體pET32a(+)的硫氧還蛋白(Trx)序列下游，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒IPSE/pET32a(+)。重組質(zhì)粒IPSE/pET32a(+)轉(zhuǎn)化進表達宿主菌E.coliBL21(DE3)中獲得含此重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子菌株。經(jīng)IPTG誘導，SDS-PAGE分析，轉(zhuǎn)化子細菌能表達分子量約35.7kDa的蛋白分子，與預計Trx-IPSE融合蛋白分子量大小相符。 3.Trx-IPSE融合蛋白純化、復性與功能研究大量制備表達產(chǎn)物，用鎳螯合親和層

6、析膠在變性條件對該重組融合蛋白進行純化，獲得純化重組Trx-IPSE融合蛋白。用大量PBS對變性融合蛋白進行透析，獲得部分復性的可溶性重組Trx-IPSE融合蛋白。免疫印漬分析表明，無論變性還是復性的Trx-IPSE融合蛋白均能夠被抗血吸蟲天然IPSE蛋白的IgG抗體所識別；以羊抗人IgE為二抗，顯示融合蛋白Trx-IPSE能與健康人血清中IgE抗體非特異性結(jié)合，說明重組表達的IPSE蛋白同樣具有與IgE抗體結(jié)合的能力。 本研究