腦灰質(zhì)促進(jìn)成骨的機(jī)制研究.pdf

1、我們知道神經(jīng)系統(tǒng)支配人體的各個(gè)系統(tǒng)和器官并對(duì)其功能進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)節(jié)。從骨組織中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維到一系列神經(jīng)功能改變可以導(dǎo)致骨組織異常的發(fā)現(xiàn)均是確鑿的證據(jù)，但臨床中發(fā)現(xiàn)骨折病人若同時(shí)伴有腦外傷，其骨折愈合過(guò)程明顯加快，甚至在未見骨折的一些關(guān)節(jié)周圍出現(xiàn)異位骨化的現(xiàn)象仍然引起了極大的關(guān)注。是什么機(jī)制導(dǎo)致了這種現(xiàn)象的發(fā)生至今仍然不明確。很多學(xué)者基于各自的研究提出了多種假設(shè)，但均沒有得到廣泛的認(rèn)可。腦外傷后是否導(dǎo)致腦組織內(nèi)某些成份釋放入血液系統(tǒng)，而其中

2、又有促進(jìn)骨折愈合的因子呢?不少學(xué)者針對(duì)血液循環(huán)中的生長(zhǎng)因子等展開了相關(guān)研究均沒有取得突破。新近的研究表明交感神經(jīng)是瘦素依賴的中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)骨代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，而骨細(xì)胞系中廣泛存在腎上腺素能受體可能起到相應(yīng)的信息傳遞作用。以上發(fā)現(xiàn)為該研究領(lǐng)域提供了新的思路和途徑。
　　 我們的前期研究發(fā)現(xiàn)：大鼠腦組織中灰質(zhì)和白質(zhì)能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，尤以灰質(zhì)的促進(jìn)作用為最強(qiáng)烈。大鼠腦灰質(zhì)提取液也能顯著地刺激原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone

3、Marrow Stromal Cells，BMSCs)和二代以后的BMSCs增殖及向成骨細(xì)胞分化。腦外傷合并骨折患者的血漿較單純骨折和單純腦外傷患者血漿對(duì)成骨細(xì)胞增殖有更明顯的促進(jìn)作用。
　　 那么，腦灰質(zhì)對(duì)成骨細(xì)胞的促進(jìn)增殖作用是否可以跨種屬普遍存在呢?腦灰質(zhì)的濃度是否和促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化程度存在什么關(guān)系?腦組織促進(jìn)成骨作用和骨系細(xì)胞中的腎上腺素能受體調(diào)節(jié)骨重建機(jī)制之間又存在什么聯(lián)系?為解答上述疑問(wèn)展開本實(shí)驗(yàn)的研究。

4、r>　　 目的：探討腦灰質(zhì)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的跨種屬現(xiàn)象，分析腦灰質(zhì)促進(jìn)成骨作用的劑量效果關(guān)系，然后研究腎上腺素受體在腦灰質(zhì)促進(jìn)成骨中的作用。
　　 方法：研究分以下幾個(gè)部分進(jìn)行：
　　 1、制作大鼠腦灰質(zhì)提取液，分別用10％NCS-MEM培養(yǎng)液進(jìn)行1000倍、100倍和10倍稀釋配制成工作液，用不同濃度工作液培養(yǎng)新生SD大鼠成骨細(xì)胞，比較各種工作液濃度對(duì)成骨細(xì)胞增殖和ALP(Alkaline Phosphatase，堿

5、性磷酸酶)合成的劑量-效果關(guān)系。
　　 2、提取豬大腦灰質(zhì)、白質(zhì)、垂體、肌肉組織，同時(shí)提取大鼠大腦灰質(zhì)、白質(zhì)、垂體、肌肉，分別制成勻漿提取液，將稀釋100倍的提取液用于培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞，比較研究各種組織提取液對(duì)成骨細(xì)胞增殖影響的差異。
　　 3、提取大鼠腦灰質(zhì)制成腦灰質(zhì)提取液，用稀釋100倍的提取液培養(yǎng)成骨細(xì)胞，培養(yǎng)液中分別加入普奈洛爾和酚妥拉明，在實(shí)驗(yàn)第1、4和7天分別用MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖，同時(shí)間點(diǎn)用PNPP法

6、檢測(cè)ALP的含量以評(píng)估成骨細(xì)胞的分化。
　　 4、分離大鼠原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞，將腦灰質(zhì)提取液(稀釋100倍)、普奈洛爾(1uM)、酚妥拉明(1uM)和腎上腺素(0.1uM)分別和聯(lián)合培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞，24小時(shí)后用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)RUNX2(Runt-related Gene2，侏儒相關(guān)基因2)、ALP、骨鈣素、RANKL(Ligand of Receptor Activator of NF-kB，核激活因子受體配體)和OP

7、G(osteoprotegerin，骨保護(hù)素)mRNA的表達(dá)量，比較不同組之間mRNA表達(dá)的差別。
　　 結(jié)果：
　　 1、大鼠腦灰質(zhì)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化的劑量-效果關(guān)系
　　 1)在腦灰質(zhì)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖方面，稀釋1000倍的腦灰質(zhì)提取液MTT值和對(duì)照組之間沒有顯著差別(P>0.05)。稀釋100倍和10倍的腦灰質(zhì)提取液MTT值對(duì)照組之間有顯著差異(P<0.01)。各組組間ANOVA Turkey分析顯示稀釋

8、1000倍、100倍和10倍三組之間存在顯著差異，提示腦灰質(zhì)提取液促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖作用和提取液的濃度有關(guān)，根據(jù)曲線趨勢(shì)可以認(rèn)為腦灰質(zhì)提取液在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)促進(jìn)增殖趨勢(shì)和濃度呈正相關(guān)。
　　 2)在腦灰質(zhì)提取液對(duì)成骨細(xì)胞合成ALP的影響方面，PNPP法檢測(cè)ALP含量在稀釋1000倍的腦灰質(zhì)提取液作用組和對(duì)照組之間存在顯著差異(P<0.01)。稀釋100倍和10倍的腦灰質(zhì)提取液ALP含量和對(duì)照組之間也有顯著差異(P<0.01)。

9、而且ANOVA turkey分析顯示該4組數(shù)據(jù)相互之間也存在顯著差異(P<0.05)。結(jié)果提示不同濃度的腦灰質(zhì)提取液均可促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，而且根據(jù)實(shí)驗(yàn)的趨勢(shì)曲線可以看到這種促進(jìn)分化的作用和腦灰質(zhì)提取液的濃度呈正相關(guān)。
　　 2、豬和大鼠的腦灰質(zhì)提取液具有最顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的能力(P<0.05)，兩者對(duì)成骨細(xì)胞的促增殖能力沒有顯著差異(P>0.05)。和空白對(duì)照相比，腦組織的各種提取液均顯著促進(jìn)了成骨細(xì)胞的增殖(P<0.05

10、)，而且異種屬和同種屬的相應(yīng)腦組織成分對(duì)成骨細(xì)胞的增殖能力沒有顯著差別(P>0.05)。
　　 3、α和β腎上腺素受體阻滯劑對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的影響。
　　 1)當(dāng)單獨(dú)往成骨細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入1uM普奈洛爾、1uM酚妥拉明時(shí)，普奈洛爾和酚妥拉明組在第1、4和第7天的成骨細(xì)胞增殖(MTT值)和對(duì)照組之間沒有顯著差別(P>0.05)。
　　 2)當(dāng)單獨(dú)往成骨細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入1uM普奈洛爾、1uM酚妥拉明時(shí)，普奈洛

11、爾和酚妥拉明組在第1、4和第7天的ALP含量和對(duì)照組之間沒有顯著差別(P>0.05)。
　　 3)和單純腦灰質(zhì)提取液培養(yǎng)組相比，往培養(yǎng)液中加入普奈洛爾或酚妥拉明均不能顯著改變成骨細(xì)胞在第1、4和7天的MTT值。
　　 4)和單純腦灰質(zhì)提取液培養(yǎng)組相比，往培養(yǎng)液中加入酚妥拉明不能顯著改變成骨細(xì)胞在第1、4和7天的ALP含量。往培養(yǎng)液中加入普奈洛爾在第1和4天的ALP含量和單純腦灰質(zhì)提取液培養(yǎng)組沒有顯著差別。在第7天時(shí)普奈洛

12、爾組的ALP含量顯著低于單純腦灰質(zhì)提取液培養(yǎng)組。
　　 4、α和β腎上腺素受體功能對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞骨相關(guān)基因(RUNX2、ALP、骨鈣素、RANKL和骨保護(hù)素)mRNA轉(zhuǎn)錄的影響
　　 1)腦灰質(zhì)提取液增加了骨髓基質(zhì)細(xì)胞的骨鈣素mRNA的轉(zhuǎn)錄，但是不影響RUNX2 mRNA、ALP mRNA轉(zhuǎn)錄和RANKL/OPGmRNA比值。
　　 2)腎上腺素降低了骨髓基質(zhì)細(xì)胞RANKL/OPG轉(zhuǎn)錄比值，但不影響RUNX2、A

13、LP和骨鈣素mRNA的轉(zhuǎn)錄。
　　 3)普奈洛爾不影響骨髓基質(zhì)細(xì)胞RUNX2、ALP和骨鈣素mRNA的轉(zhuǎn)錄和RANKL/OPG轉(zhuǎn)錄比值。
　　 4)酚妥拉明顯著增加了骨髓基質(zhì)細(xì)胞骨鈣素mRNA的表達(dá)，但對(duì)RUNX2、ALP mRNA的轉(zhuǎn)錄和RANKL/OPG轉(zhuǎn)錄比值沒有顯著影響。
　　 5)腦灰質(zhì)+腎上腺素聯(lián)合作用顯著增加了RUNX2、ALP和骨鈣素mRNA的轉(zhuǎn)錄，而且RUNX2和ALP mRNA的轉(zhuǎn)錄量較單獨(dú)腦

14、灰質(zhì)組增加也有顯著意義。但是腦灰質(zhì)+腎上腺素聯(lián)合作用不影響RANKL/OPG轉(zhuǎn)錄比值。
　　 6)腦灰質(zhì)+普奈洛爾顯著增加了骨鈣素mRNA的轉(zhuǎn)錄，但是對(duì)RUNX2和ALP mRNA轉(zhuǎn)錄和RANKL/OPG轉(zhuǎn)錄比值沒有影響。
　　 7)腎上腺素可以通過(guò)β受體協(xié)同腦灰質(zhì)提取液增加骨髓基質(zhì)細(xì)胞RUNX2和ALP mRNA的轉(zhuǎn)錄。而骨鈣素mRNA的轉(zhuǎn)錄增加是由于腦灰質(zhì)的刺激作用導(dǎo)致，而且腎上腺素不影響RANKL/OPG轉(zhuǎn)錄比值。

15、而腎上腺素也可以通過(guò)α受體協(xié)同增加RUNX2和ALP mRNA的轉(zhuǎn)錄，同樣兩者的聯(lián)合作用不影響RANKL/OPG轉(zhuǎn)錄比值。
　　 結(jié)論：
　　 1.腦灰質(zhì)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化作用呈劑量依賴性，以稀釋100倍的腦灰質(zhì)提取物進(jìn)行成骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是合適的。
　　 2.豬腦組織能跨種屬促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖，其中以腦灰質(zhì)的促進(jìn)作用最為顯著。提示腦內(nèi)固有成分促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的機(jī)制具有普遍性。
　　 3.α和β腎上腺素