腦灰質(zhì)促進成骨的機制研究.pdf

1、我們知道神經(jīng)系統(tǒng)支配人體的各個系統(tǒng)和器官并對其功能進行相應(yīng)的調(diào)節(jié)。從骨組織中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維到一系列神經(jīng)功能改變可以導(dǎo)致骨組織異常的發(fā)現(xiàn)均是確鑿的證據(jù)，但臨床中發(fā)現(xiàn)骨折病人若同時伴有腦外傷，其骨折愈合過程明顯加快，甚至在未見骨折的一些關(guān)節(jié)周圍出現(xiàn)異位骨化的現(xiàn)象仍然引起了極大的關(guān)注。是什么機制導(dǎo)致了這種現(xiàn)象的發(fā)生至今仍然不明確。很多學(xué)者基于各自的研究提出了多種假設(shè)，但均沒有得到廣泛的認可。腦外傷后是否導(dǎo)致腦組織內(nèi)某些成份釋放入血液系統(tǒng)，而其中

2、又有促進骨折愈合的因子呢?不少學(xué)者針對血液循環(huán)中的生長因子等展開了相關(guān)研究均沒有取得突破。新近的研究表明交感神經(jīng)是瘦素依賴的中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)骨代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，而骨細胞系中廣泛存在腎上腺素能受體可能起到相應(yīng)的信息傳遞作用。以上發(fā)現(xiàn)為該研究領(lǐng)域提供了新的思路和途徑。
　　 我們的前期研究發(fā)現(xiàn)：大鼠腦組織中灰質(zhì)和白質(zhì)能顯著促進成骨細胞增殖和分化，尤以灰質(zhì)的促進作用為最強烈。大鼠腦灰質(zhì)提取液也能顯著地刺激原代骨髓基質(zhì)細胞(Bone

3、Marrow Stromal Cells，BMSCs)和二代以后的BMSCs增殖及向成骨細胞分化。腦外傷合并骨折患者的血漿較單純骨折和單純腦外傷患者血漿對成骨細胞增殖有更明顯的促進作用。
　　 那么，腦灰質(zhì)對成骨細胞的促進增殖作用是否可以跨種屬普遍存在呢?腦灰質(zhì)的濃度是否和促進成骨細胞的增殖和分化程度存在什么關(guān)系?腦組織促進成骨作用和骨系細胞中的腎上腺素能受體調(diào)節(jié)骨重建機制之間又存在什么聯(lián)系?為解答上述疑問展開本實驗的研究。

4、r>　　 目的：探討腦灰質(zhì)促進成骨細胞增殖的跨種屬現(xiàn)象，分析腦灰質(zhì)促進成骨作用的劑量效果關(guān)系，然后研究腎上腺素受體在腦灰質(zhì)促進成骨中的作用。
　　 方法：研究分以下幾個部分進行：
　　 1、制作大鼠腦灰質(zhì)提取液，分別用10％NCS-MEM培養(yǎng)液進行1000倍、100倍和10倍稀釋配制成工作液，用不同濃度工作液培養(yǎng)新生SD大鼠成骨細胞，比較各種工作液濃度對成骨細胞增殖和ALP(Alkaline Phosphatase，堿

5、性磷酸酶)合成的劑量-效果關(guān)系。
　　 2、提取豬大腦灰質(zhì)、白質(zhì)、垂體、肌肉組織，同時提取大鼠大腦灰質(zhì)、白質(zhì)、垂體、肌肉，分別制成勻漿提取液，將稀釋100倍的提取液用于培養(yǎng)大鼠成骨細胞，比較研究各種組織提取液對成骨細胞增殖影響的差異。
　　 3、提取大鼠腦灰質(zhì)制成腦灰質(zhì)提取液，用稀釋100倍的提取液培養(yǎng)成骨細胞，培養(yǎng)液中分別加入普奈洛爾和酚妥拉明，在實驗第1、4和7天分別用MTT法檢測成骨細胞的增殖，同時間點用PNPP法

6、檢測ALP的含量以評估成骨細胞的分化。
　　 4、分離大鼠原代骨髓基質(zhì)細胞，將腦灰質(zhì)提取液(稀釋100倍)、普奈洛爾(1uM)、酚妥拉明(1uM)和腎上腺素(0.1uM)分別和聯(lián)合培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細胞，24小時后用實時熒光RT-PCR檢測RUNX2(Runt-related Gene2，侏儒相關(guān)基因2)、ALP、骨鈣素、RANKL(Ligand of Receptor Activator of NF-kB，核激活因子受體配體)和OP

7、G(osteoprotegerin，骨保護素)mRNA的表達量，比較不同組之間mRNA表達的差別。
　　 結(jié)果：
　　 1、大鼠腦灰質(zhì)促進成骨細胞增殖和分化的劑量-效果關(guān)系
　　 1)在腦灰質(zhì)促進成骨細胞增殖方面，稀釋1000倍的腦灰質(zhì)提取液MTT值和對照組之間沒有顯著差別(P>0.05)。稀釋100倍和10倍的腦灰質(zhì)提取液MTT值對照組之間有顯著差異(P<0.01)。各組組間ANOVA Turkey分析顯示稀釋

8、1000倍、100倍和10倍三組之間存在顯著差異，提示腦灰質(zhì)提取液促進成骨細胞的增殖作用和提取液的濃度有關(guān)，根據(jù)曲線趨勢可以認為腦灰質(zhì)提取液在本實驗濃度范圍內(nèi)促進增殖趨勢和濃度呈正相關(guān)。
　　 2)在腦灰質(zhì)提取液對成骨細胞合成ALP的影響方面，PNPP法檢測ALP含量在稀釋1000倍的腦灰質(zhì)提取液作用組和對照組之間存在顯著差異(P<0.01)。稀釋100倍和10倍的腦灰質(zhì)提取液ALP含量和對照組之間也有顯著差異(P<0.01)。

9、而且ANOVA turkey分析顯示該4組數(shù)據(jù)相互之間也存在顯著差異(P<0.05)。結(jié)果提示不同濃度的腦灰質(zhì)提取液均可促進成骨細胞的分化，而且根據(jù)實驗的趨勢曲線可以看到這種促進分化的作用和腦灰質(zhì)提取液的濃度呈正相關(guān)。
　　 2、豬和大鼠的腦灰質(zhì)提取液具有最顯著促進成骨細胞增殖的能力(P<0.05)，兩者對成骨細胞的促增殖能力沒有顯著差異(P>0.05)。和空白對照相比，腦組織的各種提取液均顯著促進了成骨細胞的增殖(P<0.05

10、)，而且異種屬和同種屬的相應(yīng)腦組織成分對成骨細胞的增殖能力沒有顯著差別(P>0.05)。
　　 3、α和β腎上腺素受體阻滯劑對成骨細胞增殖和分化的影響。
　　 1)當(dāng)單獨往成骨細胞培養(yǎng)體系中加入1uM普奈洛爾、1uM酚妥拉明時，普奈洛爾和酚妥拉明組在第1、4和第7天的成骨細胞增殖(MTT值)和對照組之間沒有顯著差別(P>0.05)。
　　 2)當(dāng)單獨往成骨細胞培養(yǎng)體系中加入1uM普奈洛爾、1uM酚妥拉明時，普奈洛

11、爾和酚妥拉明組在第1、4和第7天的ALP含量和對照組之間沒有顯著差別(P>0.05)。
　　 3)和單純腦灰質(zhì)提取液培養(yǎng)組相比，往培養(yǎng)液中加入普奈洛爾或酚妥拉明均不能顯著改變成骨細胞在第1、4和7天的MTT值。
　　 4)和單純腦灰質(zhì)提取液培養(yǎng)組相比，往培養(yǎng)液中加入酚妥拉明不能顯著改變成骨細胞在第1、4和7天的ALP含量。往培養(yǎng)液中加入普奈洛爾在第1和4天的ALP含量和單純腦灰質(zhì)提取液培養(yǎng)組沒有顯著差別。在第7天時普奈洛

12、爾組的ALP含量顯著低于單純腦灰質(zhì)提取液培養(yǎng)組。
　　 4、α和β腎上腺素受體功能對骨髓基質(zhì)細胞骨相關(guān)基因(RUNX2、ALP、骨鈣素、RANKL和骨保護素)mRNA轉(zhuǎn)錄的影響
　　 1)腦灰質(zhì)提取液增加了骨髓基質(zhì)細胞的骨鈣素mRNA的轉(zhuǎn)錄，但是不影響RUNX2 mRNA、ALP mRNA轉(zhuǎn)錄和RANKL/OPGmRNA比值。
　　 2)腎上腺素降低了骨髓基質(zhì)細胞RANKL/OPG轉(zhuǎn)錄比值，但不影響RUNX2、A

13、LP和骨鈣素mRNA的轉(zhuǎn)錄。
　　 3)普奈洛爾不影響骨髓基質(zhì)細胞RUNX2、ALP和骨鈣素mRNA的轉(zhuǎn)錄和RANKL/OPG轉(zhuǎn)錄比值。
　　 4)酚妥拉明顯著增加了骨髓基質(zhì)細胞骨鈣素mRNA的表達，但對RUNX2、ALP mRNA的轉(zhuǎn)錄和RANKL/OPG轉(zhuǎn)錄比值沒有顯著影響。
　　 5)腦灰質(zhì)+腎上腺素聯(lián)合作用顯著增加了RUNX2、ALP和骨鈣素mRNA的轉(zhuǎn)錄，而且RUNX2和ALP mRNA的轉(zhuǎn)錄量較單獨腦

14、灰質(zhì)組增加也有顯著意義。但是腦灰質(zhì)+腎上腺素聯(lián)合作用不影響RANKL/OPG轉(zhuǎn)錄比值。
　　 6)腦灰質(zhì)+普奈洛爾顯著增加了骨鈣素mRNA的轉(zhuǎn)錄，但是對RUNX2和ALP mRNA轉(zhuǎn)錄和RANKL/OPG轉(zhuǎn)錄比值沒有影響。
　　 7)腎上腺素可以通過β受體協(xié)同腦灰質(zhì)提取液增加骨髓基質(zhì)細胞RUNX2和ALP mRNA的轉(zhuǎn)錄。而骨鈣素mRNA的轉(zhuǎn)錄增加是由于腦灰質(zhì)的刺激作用導(dǎo)致，而且腎上腺素不影響RANKL/OPG轉(zhuǎn)錄比值。

15、而腎上腺素也可以通過α受體協(xié)同增加RUNX2和ALP mRNA的轉(zhuǎn)錄，同樣兩者的聯(lián)合作用不影響RANKL/OPG轉(zhuǎn)錄比值。
　　 結(jié)論：
　　 1.腦灰質(zhì)促進成骨細胞增殖和分化作用呈劑量依賴性，以稀釋100倍的腦灰質(zhì)提取物進行成骨細胞實驗是合適的。
　　 2.豬腦組織能跨種屬促進大鼠成骨細胞的增殖，其中以腦灰質(zhì)的促進作用最為顯著。提示腦內(nèi)固有成分促進成骨細胞增殖的機制具有普遍性。
　　 3.α和β腎上腺素