用于組織工程骨成骨機制研究的小鼠模型的建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、背景：臨床上因骨腫瘤、骨關(guān)節(jié)結(jié)核需手術(shù)廣泛切除，高能量創(chuàng)傷、化膿性骨關(guān)節(jié)炎等因素所致的大段骨缺損十分常見，以間充質(zhì)干細胞(MSC)為種子細胞構(gòu)建的組織工程骨被公認為修復(fù)大節(jié)段骨缺損最有希望的策略之一。組織工程骨修復(fù)骨缺損的大量實驗研究著重放在最終的成骨效果和推進臨床前研究，而對于組織工程骨構(gòu)成要素之一的種子細胞的作用機制研究鮮有涉及，既往有些研究者推測，種子細胞MSCs在體內(nèi)主要是通過直接分化成骨來彌補宿主成骨能力的不足，從而促進骨缺損

2、的修復(fù)，而在我們前期的研究中將骨組織工程的種子細胞MSCs通過綠色熒光標(biāo)記后進行體內(nèi)示蹤，發(fā)現(xiàn)移植的MSCs雖可以參與成骨，但是在新生骨組織中大量的是宿主來源的成骨相關(guān)細胞，這提示有大量的宿主細胞遷移到組織工程骨移植部位參與成骨，因此我們提出種子細胞可能的修復(fù)機制：組織工程骨被移植到骨缺損部位后，局部創(chuàng)傷產(chǎn)生了炎癥，而釋放的炎癥因子刺激了種子細胞與宿主早期炎癥浸潤的單核細胞，它們產(chǎn)生了趨化因子和細胞因子，驅(qū)使宿主的成骨相關(guān)細胞募集遷移而

3、來。動物模型是骨組織工程研究必要的載體，縱觀目前用于組織工程骨研究的各種動物模型，雖各有其優(yōu)勢但并不適合用于組織工程骨成骨機制的相關(guān)研究。
　　 目的：(1)制備簡便易行的小鼠股骨干骨缺損模型，可用于骨組織工程機理研究；(2)MSCs作為種子細胞體外復(fù)合DBM材料構(gòu)建組織工程骨，觀察細胞在材料上的增殖、分化情況；(3)將構(gòu)建好的組織工程骨移植到小鼠骨缺損模型上，觀察種子細胞的遷移和轉(zhuǎn)歸情況，驗證模型的科學(xué)性和可行性。
　　

4、 方法：(1)MicroCT測量分析小鼠股骨的解剖參數(shù)。將30只2～3月齡FVB/N品系的小鼠分成3組，每組10只，用我們自行設(shè)計的內(nèi)固定物固定后分別制備長度為1mm、2 mm和2.5 mm的股骨干中段骨和骨膜缺損模型，術(shù)后不同時相點通過影像學(xué)和組織學(xué)的方法來觀察骨缺損的愈合進程。(2)采用全骨髓細胞貼壁法分離培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，通過細胞表面的特異抗原標(biāo)志物和多向分化潛能來鑒定。(3)根據(jù)本實驗室成熟的構(gòu)建方法，將綠色熒光小鼠的

5、骨髓間充質(zhì)干細胞(mBMSCs)作為種子細胞同豬DBM構(gòu)建組織工程骨，掃描電鏡和激光共聚焦觀察細胞在DBM材料上的增殖、分化情況。(4)將普通型小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合DBM材料構(gòu)建的組織工程骨移植到綠色熒光小鼠雙側(cè)股骨干骨缺損模型上，兩側(cè)分別植入TEB和單純DBM材料進行對照，利用小動物活體成像系統(tǒng)分別于術(shù)后第3天，7天，10天進行觀察，觀察后將兩側(cè)標(biāo)本塊上的細胞消化下來行流式細胞儀分選和計數(shù)，對比兩組之間的差異，評價種子細胞是否募集

6、了更多的宿主細胞參與局部骨缺損的修復(fù)，進一步驗證模型的有效性。
　　 結(jié)果：(1)通過測量得到小鼠股骨的解剖參數(shù)：股骨長度(15.48±0.73)mm；股骨干中部橫徑(1.38±0.20)mm；矢狀徑(2.05±0.05)mm；髓腔直徑(0.75±0.80)mm，除去股骨髁和小轉(zhuǎn)子以上的部分，股骨干長度為8.5mm。建模術(shù)后第7、28、56、84天分別對實驗小鼠進行鉬靶X線拍攝觀察，可見骨缺損長度為1mm的實驗組：骨缺損術(shù)后第7

7、d內(nèi)固定位置良好，骨缺損兩斷端對位對線良好，缺損端清晰銳利；骨缺損術(shù)后第28d內(nèi)固定物固定牢靠無移位，骨缺損端有纖維骨痂形成；第56d骨缺損處可見形成大量的骨痂，骨痂密度高；骨缺損術(shù)后第84d骨缺損處已有連續(xù)性骨痂通過，達到臨床愈合。骨缺損長度為2mm的實驗組：術(shù)后第28d內(nèi)固定位置好，骨缺損端折線變得模糊；術(shù)后第84d骨缺損斷端變得圓鈍，骨痂生長不明顯。缺損長度為2.5mm的實驗組：骨缺損術(shù)后連續(xù)觀察，內(nèi)固定位置良好，骨斷端無成角、短

8、縮移位。術(shù)后84d，缺損處無明顯骨痂生長，斷端折線顯示較為銳利，可見類似軟組織影充填。組織學(xué)觀察術(shù)后84d，HE染色結(jié)果顯示，骨缺損長度為1 mm的實驗組缺損處可見大量的新生骨小梁組織填充，髓腔再通；骨缺損長度為2 mm的實驗組可見在一側(cè)的缺損骨端有少量成骨，缺損處纖維組織充填，纖維組織與骨端的邊界清楚；骨缺損長度為2.5mm的實驗組可見缺損處充填著大量的纖維結(jié)締組織，無骨組織生成。(2)采用全骨髓細胞貼壁法分離的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，

9、鏡下可見貼壁生長，呈典型的成纖維細胞形態(tài)，流式細胞儀檢測所培養(yǎng)第二代小鼠MSCs的細胞表型：MSCs特異性抗原CD105高表達(92.7%)；造血系抗原CD34和CD45低表達；內(nèi)皮細胞系抗原CD31低表達；病理特殊染色證實細胞具有向成骨、成脂分化的能力。(3)FVB/N品系的小鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞，將其同豬DBM材料體外構(gòu)建TEB，通過激光共聚焦成像技術(shù)和掃描電鏡技術(shù)觀察到細胞種植到DBM材料上以后，隨著時間的推移，細胞增殖分化良好，

10、能夠在材料的表面和孔隙內(nèi)緊密貼附并伸出突觸，熒光強度逐漸增強，細胞呈成纖維細胞形態(tài)。(4)構(gòu)建雙側(cè)小鼠股骨缺損模型，無一例失敗，術(shù)后3d的股骨標(biāo)本大體觀無明顯差異，熒光成像觀察TEB組和DBM組股骨缺損處幾乎看不到綠色熒光；術(shù)后7d觀察股骨缺損處材料塊上兩組都有大量的細胞基質(zhì)，熒光成像可見TEB組和DBM組股骨缺損處局部可見明顯的綠色熒光表達，TEB組較DBM組熒光表達稍強。術(shù)后10d股骨標(biāo)本大體觀察兩組均可見缺損處材料上可見有纖維肉芽

11、組織覆蓋，熒光成像顯示兩組股骨缺損處局部均具有顯著的熒光表達，TEB組與DBM組對比熒光明顯較強烈，表明移植術(shù)后10d，TEB組較單純DBM組骨缺損處有更多宿主來源的綠色熒光細胞。小動物成像觀察結(jié)束后立即將材料塊上的細胞消化下來進行流式細胞分選和計數(shù)，表明術(shù)后7天和10天，TEB實驗組相比單純DBM組，表達綠色熒光的細胞量顯著較多。
　　 結(jié)論：(1)構(gòu)建的小鼠股骨干骨缺損模型在不填充任何材料的情況下，Imm的實驗組能過通過自身

12、修復(fù)愈合，而2mm以上的實驗性骨缺損在術(shù)后3個月牢靠固定的情況下仍不能自行愈合，符合臨界骨缺損的標(biāo)準，能夠滿足我們后續(xù)的實驗需求。(2)采用全骨髓細胞貼壁的方法分離培養(yǎng)的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞具有良好的增殖分化潛能，通過表面標(biāo)記物以及多向分化潛能鑒定證實是實驗所需的骨髓間充質(zhì)干細胞，(3)DBM材料具有天然的三維網(wǎng)孔骨結(jié)構(gòu)，大孔隙內(nèi)部雖有大量小孔隙相互連通，但孔徑仍相對較大，掃描電鏡圖像測量DBM的孔隙率約為76%，DBM材料具有良好的細