組織工程人工骨成骨活性因子(BMP9,OPG)相關研究.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是作為成骨因子最初在骨基質中發(fā)現的，BMPs是轉化生長因子β(TGF-β)超家族的成員之一，目前已經分離和鑒定的有20余種。BMP主要的生物學作用是誘導成骨潛能細胞，如結締組織中的間質細胞、骨髓基質細胞、滑膜細胞和成纖維細胞等在骨骼或骨骼外轉化形成軟骨和骨組織。除了促進成骨分化的作用以外，BMPs在很多組織和器官的發(fā)育中也發(fā)揮著重要的作用，比如：心，肺，腎，眼睛，生殖組織，神經系統(tǒng)，胎盤和胎盤連接，血管和血管生成

2、，脂肪組織的形成。
　　 目前發(fā)現的具有誘導成骨分化能力的BMP主要有BMP2、4、6、7、9，其中rhBMP2和rhBMP7純蛋白已經在國外臨床上用于骨折延遲愈合、骨折不愈合、骨折骨不連、骨缺損、脊柱融合術的治療，而且取得了一定的治療效果。C2C12、C3H10細胞以及裸鼠皮下注射的體外和體內實驗對AdBMP2、4、6、7、9進行研究，結果提示BMP9誘導成骨能力遠遠強于傳統(tǒng)應用的BMP2和BMP7。
　　 以往的研究

3、已經在細胞和小動物水平證實了BMP9的成骨能力，但是BMP9在更接近于人類的大動物體內研究尚未有報道。進一步對BMP9和BMP2、BMP4、BMP6、BMP7之間的協同作用進行研究，結果發(fā)現BMP之間存在協同作用，其中BMP9和BMP2的協同作用最強。單獨BMP9以及BMP9和其它BMP的協同運用為組織工程人工骨成骨活性因子提供了一個新的選擇。但是由于BMP9相關的大動物水平的研究相當缺乏，在大動物水平，特別是負重骨骨缺損模型上研究BM

4、P9自身的成骨能力、BMP之間的協同作用已經十分必要。為了更好地研究BMP之間的協同作用，如何避免因為基因表達相互干擾和腺病毒滴度測定中的誤差對實驗結果的準確性造成影響，使各種BMP的表達達到1∶1的水平也是急需解決的問題。
　　 骨保護素(OPG)也稱為破骨細胞生成抑制因子，是一種分泌型糖蛋白，由401個氨基酸組成。OPG主要通過調節(jié)RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)，促進新骨的生成，抑制骨的吸收，從而達到促進成骨的作用。RAN

5、KL是骨保護素的同源配基，主要表達于成骨細胞和骨髓基質細胞的表面，RANK主要表達于破骨細胞或其前體表面。RANKL與RANK結合后可以促進破骨細胞的活化、成熟，從而促進骨吸收。OPG是RANKL的誘餌受體，與RANK競爭性結合RANKL，OPG與RANKL的結合減少了RANKL與RANK的結合，從而抑制破骨細胞分化、成熟，減少骨吸收。另外OPG能夠通過誘導堿性磷酸酶和鈣化結節(jié)形成促進大鼠骨髓間充質干細胞的成骨分化，可視為一種良好的骨誘

6、導活性因子。
　　 骨活素膠囊系在護骨膠囊的基礎上改良而得，是純中藥提取的，其主要成分淫羊藿苷可通過促進成骨細胞分泌骨保護素，調節(jié)RANKL/RANK/OPG的動態(tài)平衡機制，從而有效地減少骨吸收，間接地促進了骨生成。由于骨活素膠囊是純中藥提取，毒副作用小，可以有效地治療骨質疏松癥，而且骨活素膠囊促進了OPG的分泌，OPG又可以通過調節(jié)骨代謝和骨誘導促進骨再生，所以骨活素膠囊為骨折、骨缺損伴有骨質疏松癥的病人提供了一個很好的選擇。

7、但是目前尚未有這方面的研究報道。在對骨質疏松性骨折進行治療時離不開手術對骨折部位的復位和固定，利用合理的手術方式既能對骨折進行良好的復位和固定，又能最大程度上對骨折部位及周圍進行保護，將有利于骨質疏松性骨折的愈合。
　　 目的：
　　 1、觀察BMP9介導的人工骨在大動物負重骨骨缺損模型(山羊股骨中段臨界骨缺損模型)中的促進成骨能力。
　　 2、構建雙表達BMP2、9腺病毒載體，使BMP2和BMP9達到精確的1∶

8、1表達，進一步驗證和研究BMP2和BMP9的協同效應。
　　 3、觀察骨活素膠囊在骨質疏松性骨折模型(兔橈骨骨質疏松性骨折模型)中的成骨情況，探討OPG用于人工骨組成部分的可能性。
　　 4、介紹一種新型的微創(chuàng)手術方式治療骨質疏松性骨折，為人工骨治療骨折疏松提供良好的復位和固定。
　　 第一部分：
　　 方法：12只12-18月齡中國青山羊，股骨中段建立臨界骨缺損模型，隨機分為兩組，缺損區(qū)域明膠海綿填充，

9、實驗組加入預先準備好的BMP9腺病毒感染的骨髓基質細胞懸液，對照組加入GFP腺病毒感染的骨髓基質細胞懸液，術后1天、2周、4周、8周、12周、20周行X片檢查，20周時進行CT檢查，處死動物，行大體標本、組織學染色和生物力學的檢測。
　　 結果：X片顯示實驗組較對照組骨痂形成更早更多，大體標本、組織學染色顯示實驗組的新生骨更加成熟，CT顯示實驗組新生骨塑形更好，生物力學檢測顯示實驗組新生骨痂的力學強度更強。
　　 結論：

10、BMP9介導的組織工程人工骨可以有效地促進山羊股骨骨缺損的愈合。同時實驗結果也發(fā)現BMP9在體內能夠促進脂肪的分化。治療五個月后BMP9人工骨治療組與正常骨在形態(tài)和生物力學特性上仍有差距，如何避免脂肪分化，尋找更強的成骨活性因子組合有待進一步研究。
　　 第二部分：
　　 方法：自單一表達BMP2或BMP9 AdEasy質粒上擴增BMP2和BMP9片段，先后亞克隆至穿梭質粒pASG2，獲得雙表達穿梭質粒pASG2-BMP

11、2、9，酶切及PCR鑒定確認、測序正確后同源重組獲得雙表達BMP2、BMP9腺病毒質粒，轉染至HEK-293細胞中包裝和擴增得到高滴度雙表達BMP2、BMP9腺病毒，體外感染C3H10細胞RT-PCR鑒定其表達并觀察其早期誘導成骨情況。
　　 結果：成功構建雙表達BMP2、BMP9的腺病毒，滴度約為1010IU/ml，RT-PCR證實此腺病毒在C3H10細胞中表達，觀察到綠色熒光，其感染C3H10細胞的早期堿性磷酸酶含量較感染單

12、一表達BMP2或BMP9腺病毒的C3H10細胞增加。
　　 結論：成功構建雙表達BMP2、9的重組腺病毒載體，初步驗證了BMP2、9能夠早期協同成骨，為進一步研究BMP2和BMP9的協同成骨作用和制備高效的組織工程人工骨提供了有利的工具。
　　 第三部分：
　　 方法：40只8-12月齡雌性新西蘭大耳兔，卵巢去勢法10周得到I型骨質疏松模型，再行橈骨骨折造模，從而建立骨質疏松性骨折模型。模型建立后隨機分為2組，實

13、驗組和對照組分別給予含1g/kg·d骨活素膠囊的生理鹽水和淀粉糊5ml灌胃，在2、4、8周隨機選取動物行影像學、血液生化指標、HE染色、pcna免疫組化和生物力學檢測。
　　 結果：骨活素干預的實驗組動物較對照組骨痂、骨小梁形成增多增快，骨痂力學強度增強。
　　 結論：骨活素膠囊能使骨質疏松性骨折的愈合時間縮短，強度增強。
　　 第四部分：介紹一種微創(chuàng)外科手術方式(椎體后凸成形術)，為骨質疏松性骨折人工骨替代治療

14、提供新的選擇。
　　 方法：2006年3月-2007年8月，收治60例骨質疏松性脊柱骨折患者。其中40例選擇椎體后凸成形術治療(試驗組)，20例選擇保守治療(對照組)。試驗組：男6例，女34例；年齡56～78歲，平均68.7歲。病程10～18個月，平均12個月。骨折涉及73個椎體。對照組：男5例，女15例；年齡57～80歲，平均70.1歲。病程9～16個月，平均13個月。骨折涉及41個椎體。兩組患者性別、年齡、病程、疼痛視覺模擬

15、評分(VAS)、歐洲脊柱骨質疏松癥研究(EVOS)問卷評分，以及傷椎前中柱椎體高度、后凸Cobb角比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。
　　 結果：試驗組患者術后切口均I期愈合，無骨水泥滲漏。兩組患者均獲隨訪，隨訪時間36～38個月。試驗組治療后1～3 d及12、36個月VAS評分、EVOS評分、傷椎前中柱椎體高度及后凸Cobb角均較術前明顯改善(P<0.05)；對照組治療后以上指標與術前比較無改善(P>0.0

16、5)。治療后12、36個月，試驗組以上指標均優(yōu)于對照組(P<0.05)。治療后36個月，對照組患者新發(fā)脊柱骨折發(fā)生率高于試驗組(x2=16.347，P=0.015)。
　　 結論：椎體后凸成形術治療骨質疏松性脊柱骨折后，疼痛癥狀可明顯緩解，活動功能恢復，且新發(fā)脊柱骨折發(fā)生率較保守治療低。
　　 綜上所述，BMP9的誘導成骨能力在大動物骨缺損模型中得到證實，BMP2和BMP9具有協同效應，OPG能夠促進OPF的愈合，PKP