對BMP-9誘導(dǎo)成骨、成脂肪作用的調(diào)節(jié)研究.pdf

1、目的:
　　 1.通過AdEasy系統(tǒng)和piggyBac系統(tǒng)構(gòu)建腺病毒載體和基因穩(wěn)定高表達細胞株，從而建立起穩(wěn)定、高效的目的基因調(diào)控方法。
　　 2.通過腺病毒載體和基因穩(wěn)定高表達細胞株研究BMP-9和Nell-1基因在成骨、成脂肪方面的相互作用，從而明確Nell-1基因?qū)τ葿MP-9誘導(dǎo)的成骨和成脂肪作用的影響。
　　 3.通過腺病毒載體調(diào)節(jié)Creld2基因表達，通過觀察成骨指標(biāo)的改變明確Creld2在BMP-

2、9誘導(dǎo)的成骨過程中的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:
　　 1.構(gòu)建Nell-1基因腺病毒載體:通過Hi-Fi PCR擴增Nell-1基因全序列后將其包裝入質(zhì)粒，隨后利用AdEasy系統(tǒng)在HEK293細胞中包裝Nell-1基因相關(guān)腺病毒載體，利用熒光、RT PCR以及功能檢測明確其作用。
　　 2.構(gòu)建Nell-1基因穩(wěn)定高表達細胞株:利用piggyBac系統(tǒng)將質(zhì)粒中的Nell-1基因全序列轉(zhuǎn)座進間充質(zhì)干細胞基因組中，通

3、過RT PCR和相關(guān)功能檢測明確Nell-1基因表達上調(diào)。
　　 3.Nell-1基因?qū)MP-9功能影響:通過腺病毒載體和穩(wěn)定高表達細胞株進行RT PCR分析成骨和成脂肪相關(guān)基因的表達，測定堿性磷酸酶活性和鈣結(jié)節(jié)染色、油紅0染色以及動物實驗與細胞周期分析檢測 Nell-1基因?qū)MP-9誘導(dǎo)成骨、成脂肪作用的影響。
　　 4.Creld2基因?qū)MP-9成骨功能的調(diào)節(jié):通過腺病毒載體改變Creld2基因的表達，并對堿性

4、磷酸酶活性、成骨標(biāo)志基因的表達以及鈣鹽沉積等方面進行檢測，最后利用動物實驗分析Creld2對BMP-9誘導(dǎo)的成骨作用的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.腺病毒載體和穩(wěn)定細胞株:腺病毒載體能夠感染細胞并表達相應(yīng)熒光，通過收集腺病毒載體感染后的細胞總RNA以及穩(wěn)定高表達細胞株的總RNA，進行RT PCR后證實目的基因表達能夠被有效調(diào)節(jié)，同時進行ALP染色等功能試驗與對照組也有明顯差異。
　　 2.Nell-1基因?qū)M

5、P-9的功能影響:(1)在體外實驗中Nell-1基因無法有效誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化，但與BMP-9聯(lián)合作用后，能夠抑制由BMP-9誘導(dǎo)的ALP表達，但鈣鹽沉積明顯增強并能抑制由BMP-9誘導(dǎo)的成脂肪作用，當(dāng)Nell-1基因受到抑制時BMP-9誘導(dǎo)的成脂肪作用明顯加強。(2)在動物實驗中Nell-1無法有效誘導(dǎo)異位成骨，但與BMP-9合用后較BMP-9單獨作用雖然包塊體積略小但密度更高，染色顯示骨小梁更為粗壯、成熟，同時脂肪組織更少。

6、>　　 3.Creld2基因?qū)MP-9成骨功能的調(diào)節(jié):(1)在體外實驗中當(dāng)Creld2基因表達上調(diào)時，由BMP-9誘導(dǎo)的成骨標(biāo)志明顯表達明顯上升，但當(dāng)Creld2表達受到抑制時，成骨作用明顯減弱。(2)在動物實驗中，Creld2與BMP-9聯(lián)合組包塊較BMP-9單獨組更大且骨小梁成分更多，當(dāng)Creld2被抑制由BMP-9誘導(dǎo)的成骨效果明顯變差。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過AdEasy系統(tǒng)和piggBac系統(tǒng)制作腺病