鑒定分析與BMP9誘導(dǎo)成骨有關(guān)的TGFβ受體.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factorβ，TGFβ)超家族的成員之一，最初因?yàn)槠淠苷T導(dǎo)骨和軟骨的形成而得名，目前認(rèn)為，BMPs與系統(tǒng)發(fā)育中的細(xì)胞增殖和分化有關(guān)，BMPs可以調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向骨、軟骨、肌腱和脂肪分化。至今共分離和鑒定了20余種BMPs，主要已報(bào)道的具有誘導(dǎo)成骨活性的BMPs為BMP2、5、7等，其中BMP2和

2、BMP7已經(jīng)被用于臨床治療，但在臨床實(shí)際應(yīng)用上效果還不能令人滿意。因此，尋找更強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化的細(xì)胞因子成為目前共同關(guān)注的課題，也是臨床的迫切需要。 在實(shí)驗(yàn)室的前期研究工作中，我們通過(guò)重組腺病毒介導(dǎo)的方法，系統(tǒng)研究了BMP2～BMP15共14種BMPs在誘導(dǎo)骨形成中的的作用。采用間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10細(xì)胞系，分別在體外和裸鼠體內(nèi)進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)除傳統(tǒng)BMP2、7外，BMP4、6、9也具有誘導(dǎo)成骨作用，其中BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)

3、胞C3H10成骨的作用，遠(yuǎn)強(qiáng)于傳統(tǒng)應(yīng)用的BMP2和BMP7。BMP9是目前已知的BMPs(包括BMP2、BMP7)中誘導(dǎo)成骨能力最強(qiáng)的因子，有希望作為一種更強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞成骨分化的細(xì)胞因子替代品，因此具有廣闊的潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。 但是，BMP9誘導(dǎo)成骨的機(jī)制目前并不十分清楚。作為TGFβ家族成員，所有的BMPs(包括BMP9)都主要通過(guò)TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路傳遞信號(hào)，發(fā)揮其誘導(dǎo)成骨的功能。首先BMPs與具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的

4、跨膜TGFβⅡ型和Ⅰ型受體結(jié)合，啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，隨后，磷酸化的Ⅰ型受體激活轉(zhuǎn)錄因子Smads，由激活的Smads調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)。因此，在BMPs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，TGFβ受體起著承上(與BMPs結(jié)合)和啟下(活化Smads)的作用，是BMPs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，是BMPs早期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的最重要的分子之一，與BMPs發(fā)揮誘導(dǎo)成骨的活性關(guān)系密切。BMP2和BMP7等成骨性BMPs，其相關(guān)的TGFβ受體已經(jīng)被鑒定和分析清楚，但是與BMP

5、9誘導(dǎo)成骨有關(guān)的TGFβ受體，目前了解很少，這也限制了對(duì)于BMP9誘導(dǎo)成骨機(jī)制的揭示?；谝陨戏治?，本研究綜合應(yīng)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)等多項(xiàng)技術(shù)，如細(xì)胞培養(yǎng)、基因克隆、基因轉(zhuǎn)染、重組腺病毒、細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)技術(shù)、real time PCR、動(dòng)物模型、Micro-CT、組織化學(xué)染色等，主要鑒定分析與BMP9誘導(dǎo)成骨有關(guān)的TGFβ受體，為BMP9誘導(dǎo)成骨的機(jī)制，在受體水平上提供證據(jù)。整個(gè)研究分為兩大部分，主要研究結(jié)果如下：

6、 第一部分研究中，我們分析已知的七種TGFβⅠ型受體和四種TGFβⅡ型受體的核苷酸序列，PCR擴(kuò)增含受體胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域部分的片段，并將片段克隆入腺病毒穿梭質(zhì)粒載體pAdtrace-TO4，通過(guò)菌落PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和DNA序列測(cè)定對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定，得到共11種TGFβ受體相應(yīng)的顯性負(fù)性突變體(dn-receptor)質(zhì)粒；隨后，在BJAdeasy細(xì)菌中同源重組dn-receptor腺病毒質(zhì)粒，重組dn-receptor腺

7、病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，使腺病毒在其中包裝和擴(kuò)增，最后得到11種dn-receptor重組腺病毒。將制備的dn-receptor腺病毒感染目標(biāo)細(xì)胞C3H10，在感染24小時(shí)后，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)11種dn-receptor腺病毒均可在C3H10內(nèi)表達(dá)RFP紅色熒光蛋白，產(chǎn)生紅色熒光；在病毒感染C3H10細(xì)胞48小時(shí)后，提取細(xì)胞RNA，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，所有11種dn-receptor均可在C3H10細(xì)胞內(nèi)表達(dá)

8、。通過(guò)這部分實(shí)驗(yàn)，我們最終獲得了11種TGFβ受體相應(yīng)的顯性負(fù)性突變體腺病毒，并驗(yàn)證了其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。顯性負(fù)性突變的TGFβ受體可以與細(xì)胞內(nèi)的野生型受體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)配體，抑制配體功能的發(fā)揮。該部分制備的腺病毒用于第二部分實(shí)驗(yàn)，而且也可以用于TGFβ信號(hào)通路中與TGFβ受體有關(guān)的相關(guān)研究。 第二部分研究中，首先在體外實(shí)驗(yàn)中，我們利用顯性負(fù)性突變型TGFβ受體腺病毒和BMP9共同作用間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維

9、細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)和鼠成肌細(xì)胞C2C12，通過(guò)ALP定性和定量試驗(yàn)以及熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)，初步篩選出了5種dn-receptor可以抑制BMP9誘導(dǎo)的ALP和熒光素酶活性，它們分別是dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，它們對(duì)于ALP表達(dá)的抑制存在劑量依賴性，而且還可以抑制C3H10和MEFs細(xì)胞的鈣鹽沉積，抑制細(xì)胞的成骨

10、分化；通過(guò)Real-time PCR發(fā)現(xiàn)dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB這5dn-receptor可以抑制BMP9靶基因(Smad6，Smad7和Id1)的表達(dá)。將dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB和BMP9共感染C3H10細(xì)胞，在裸鼠皮下進(jìn)行注射，5周后觀察并剝離皮下包塊，Micro-CT掃描和影像重建；石蠟包埋、切片，組織化學(xué)染色觀察包塊內(nèi)

11、細(xì)胞成骨情況，結(jié)果顯示與對(duì)照相比，dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB處理組成骨包塊偏小，而且其包塊內(nèi)成骨不活躍，表明dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB可以抑制BMP9誘導(dǎo)的C3H10在裸鼠皮下的成骨。從以上結(jié)果看這五種dn-recepotr相應(yīng)的野生型受體(ALK1、ALK2、BMPRⅡ、ActRⅡ和ActRⅡB)很可能與BMP9誘導(dǎo)成骨有關(guān)。因

12、此，我們利用pSOS系統(tǒng)篩選了能抑制相應(yīng)受體表達(dá)的siRNA(首先測(cè)試了ALK1和ALK2)，再利用RNAi抑制ALK1和ALK2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抑制ALK1和ALK2表達(dá)后，BMP9誘導(dǎo)的熒光素酶活性可相應(yīng)被抑制。綜上所述，本研究從細(xì)胞水平到動(dòng)物整體水平，全面鑒定分析了可能與BMP9誘導(dǎo)成骨有關(guān)的TGFβ受體，從整個(gè)研究中我們得到以下研究結(jié)論： 1.TGFβ受體與BMP9誘導(dǎo)成骨活性密切相關(guān)，相應(yīng)dn-receptor可以抑制BM

13、P9誘導(dǎo)的細(xì)胞成骨分化。 2.構(gòu)建和制備的dn-receptor腺病毒可以有效地在目標(biāo)細(xì)胞中表達(dá)相應(yīng)的dn-recepotr，因此，它們不但可以用于BMP9相關(guān)TGFβ受體的研究和分析，也可以用于TGFβ家族其它分子的研究(如BMP13，BMP14，它們對(duì)于軟骨形成有重要作用，其相關(guān)的TGFβ受體未知)。 3.通過(guò)測(cè)試C3H10、BMSC、MEFs和C2C12四種細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：在7種Ⅰ型dn-receptor中，dnALK1

14、和dnALK2能有效抑制BMP9誘導(dǎo)的熒光素酶活性和早期成骨指標(biāo)ALP活性；在4種Ⅱ型dn-receptor中，dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ、dnActRⅡB可以有效抑制BMP9誘導(dǎo)的熒光素酶活性和ALP活性，而且這種抑制作用具有劑量依賴性。 4.進(jìn)一步研究證實(shí)，dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ、dnActRⅡB可以有效抑制BMP9誘導(dǎo)的鈣鹽沉積，并且可抑制BMP9調(diào)控的相關(guān)靶基因基因(Sma

15、d6，Smad7，Id1)的表達(dá)。因此，在11種TGFβ受體中，ALK1、ALK2、BMPRⅡ、ActRⅡ、ActRⅡB可能與BMP9誘導(dǎo)成骨有關(guān)。 5.通過(guò)pSOS系統(tǒng)篩選了能有效抑制ALK1、ALK2表達(dá)的小分子干擾RNA(siRNA)，發(fā)現(xiàn)在利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制C3H10細(xì)胞種ALK1、ALK2表達(dá)后，繼而可抑制BMP9誘導(dǎo)的熒光素酶活性，初步顯示在抑制目標(biāo)細(xì)胞相關(guān)TGFβ受體表達(dá)后，BMP9成骨活性受到了抑