Chitosan-PB-MSCs可注射組織工程骨用于骨質(zhì)疏松種植修復(fù)的初步研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松是以骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化為特征的一種系統(tǒng)性骨代謝疾病，頜骨作為全身骨骼的一部分，與全身其他骨骼一樣會受到骨質(zhì)疏松的影響，導(dǎo)致頜骨內(nèi)骨組織的數(shù)量和質(zhì)量下降，使種植體植入后愈合時間延長，BIC、BD、BA下降，對種植牙長期穩(wěn)定的發(fā)揮功能構(gòu)成了威脅；同時，骨質(zhì)疏松加快了剩余牙槽嵴吸收速度，降低牙槽嵴高度和寬度，使牙槽骨擴增術(shù)面臨著更大的失敗風(fēng)險。鑒于此，骨質(zhì)疏松被認(rèn)為是種植牙治療的相對危險癥。針對骨質(zhì)疏松患者，如何使種植體快速

2、達(dá)到良好的骨整合狀態(tài)，如何對萎縮的牙槽骨成功進(jìn)行擴增，是很多種植科臨床醫(yī)生關(guān)注的問題。
　　 本研究從外周血中獲得可以作為骨組織工程種子細(xì)胞的PB-MSCs；改良了殼聚糖凝膠使其能良好的保持種子細(xì)胞的活力；利用這兩者構(gòu)建一種可注射組織工程骨，應(yīng)用到骨質(zhì)疏松兔種植體周圍，結(jié)果該可注射組織工程骨在種植體骨外懸空部分周圍形成了新生骨組織與種植體緊密接觸，在種植體骨內(nèi)部分近心端形成較強的白色阻射影像。這提示該可注射組織工程骨在體內(nèi)可以形

3、成新生骨組織，既可以用于牙槽骨擴增術(shù)，也可以提高骨質(zhì)疏松狀態(tài)下BD、BA，進(jìn)一步詳細(xì)的深入研究有待以后進(jìn)行。
　　 實驗一骨髓與外周血間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)
　　 目的：研究外周血是否可以與骨髓一樣作為骨組織工程種子細(xì)胞來源。
　　 方法：自腹主動脈抽取1月齡左右新西蘭兔外周血，密度離心法分離兔外周血單個核細(xì)胞，沖洗收集長骨內(nèi)骨髓，將兩者在體外進(jìn)行培養(yǎng)。取P4代細(xì)胞，利用RT-PCR法檢測表面分子標(biāo)志物表達(dá)情況

4、；進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，油紅0染色觀察脂滴形成情況；進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，組織學(xué)染色觀察ALP、I型膠原的表達(dá)及礦化結(jié)節(jié)形成情況。
　　 結(jié)果：骨髓原代培養(yǎng)細(xì)胞集落形成早，細(xì)胞形態(tài)均一，呈典型的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，CD29表達(dá)陽性，CD34表達(dá)陰性。成脂誘導(dǎo)時大部分分化為脂肪細(xì)胞。成骨誘導(dǎo)1w時ALP表達(dá)陽性，3w時I型膠原表達(dá)陽性，4w時形成數(shù)量較多的礦化結(jié)節(jié)。外周血原代培養(yǎng)細(xì)胞集落形成晚，細(xì)胞形態(tài)不一，種類多。細(xì)胞CD29表達(dá)陽性，CD34表

5、達(dá)弱陽性。成脂誘導(dǎo)10d時部分細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。成骨誘導(dǎo)2w時ALP表達(dá)陽性、4w時I型膠原表達(dá)陽性，5w時有礦化結(jié)節(jié)形成，同時有管樣結(jié)構(gòu)形成。
　　 結(jié)論：外周血內(nèi)含有多向分化潛能干細(xì)胞，成骨誘導(dǎo)時能分化為成骨細(xì)胞并形成礦化結(jié)節(jié)。外周血可以作為組織工程骨的種子細(xì)胞來源。
　　 實驗二一種細(xì)胞活性保持良好的殼聚糖凝膠的制備
　　 目的：通過減少鹽酸的濃度，升高殼聚糖溶液的PH值，減少交聯(lián)劑β-GP用量，使殼聚糖

6、凝膠具有生理滲透壓，更好的保持細(xì)胞活性。
　　 材料與方法：用不同濃度鹽酸配制2％殼聚糖溶液：A組，0.1M；B組，0.09M；C組，0.08M；D組，0.07M；E組，0.07M；A-D組常溫攪拌溶解，E組高溫攪拌溶解。持續(xù)攪拌6h后高溫高壓消毒。β-GP溶液分為3種濃度(w/v)：I組，11％；II組，25％；III組，50％。4ml殼聚糖溶液與1mlβ-GP溶液混勻組成殼聚糖凝膠，測量不同組分殼聚糖凝膠PH值并記錄其在37

7、℃時凝固所需時間。取E+I、D+II、D+III三組凝膠與外周血間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞混合凝固后體外培養(yǎng)3d，利用MTT檢測凝膠內(nèi)細(xì)胞活力保持情況。
　　 結(jié)果：鹽酸濃度越低，消毒造成的殼聚糖溶液粘度損失越小，所獲得的殼聚糖凝膠PH值越高，由不凝固變?yōu)槟袒蚰趟钑r間越短。E+I組凝膠中大多數(shù)細(xì)胞具有活性，D+II組凝膠中少數(shù)細(xì)胞具有活性，D+III凝膠中只有個別細(xì)胞具有活性。
　　 結(jié)論：E+I組凝膠合2.2％β-GP，具備

8、生理滲透壓，PH值為7.13，凝固時間為20min，能很好的保持細(xì)胞的活性。
　　 實驗三去勢法骨質(zhì)疏松兔模型的建立及下頜牙槽骨的改變
　　 目的：去勢法建立兔骨質(zhì)疏松模型并觀察下頜牙槽骨的改變。
　　 方法：20只雌性新西蘭兔平均隨機分為兩組，手術(shù)組行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)，對照組行假手術(shù).檢測術(shù)前及術(shù)后3m、6m血清中OC與TRAP水平、股骨與腰椎BMD。術(shù)后6m處死所有實驗用兔，下頜骨脫礦后制作5μm切片，組織學(xué)染

9、色觀察頦孔附近骨形態(tài)，光鏡下測量下頜中切牙內(nèi)側(cè)骨層厚度，拍片后使用photoshop軟件計算下頜中切牙下方內(nèi)側(cè)骨面積比例。
　　 結(jié)果：手術(shù)組OC水平術(shù)后3m(3.39±0.63μg/L)、6m(3.22±0.98μg/L)高于假手術(shù)組(2.46±0.68μg/L；2.17±0.57μg/L，P<0.05)；TRAP術(shù)后3m(OD值0.389±0.061)、6m(OD值0.371±0.051)高于假手術(shù)組(OD值：0.332±0

10、.039；0.308±0.029，P<0.05)。術(shù)后3m兩組的股骨、腰椎BMD無統(tǒng)計學(xué)差異.術(shù)后6m手術(shù)組股骨BMD(0.349±0.056g/cm3)、腰椎BMD(0.257±0.042g/cm3)均低于假手術(shù)組(股骨0.481±0.086g/cm3，P<0.01；腰椎0.360±0.042g/cm3，P<0.01)。術(shù)后6m手術(shù)組下頜骨松質(zhì)骨內(nèi)骨小梁變細(xì)，排列稀疏甚至消失，手術(shù)組下頜中切牙內(nèi)側(cè)骨層厚度(0.52±0.16mm)較假

11、手術(shù)組(0.85±0.14mm，P<0.01)變??；中切牙內(nèi)下方骨小梁面積比(51.7±11.6％)明顯低于假手術(shù)組(82.6±9.2％，P<0.01)。
　　 結(jié)論：去勢法兔骨質(zhì)疏松模型成熟可靠。下頜牙槽骨表現(xiàn)出明顯的骨質(zhì)疏松樣改變，提示骨質(zhì)疏松狀態(tài)下進(jìn)行種植牙治療有必要采取一些特殊措施來保證治療的成功。
　　 實驗四可注射組織工程骨用于骨質(zhì)疏松種植修復(fù)的初步探索
　　 目的：將可注射組織工程骨安全有效的應(yīng)用于

12、種植體研究，初步觀察其在骨質(zhì)疏松狀態(tài)下修復(fù)種植體周圍骨量不足的效果。
　　 方法：(1)9只正常新西蘭兔分為3組，每組3只，將1ml E+I配制的殼聚糖凝膠按照不同方式應(yīng)用于種植部位骨內(nèi)：第一組種植窩制備前注入；第二組種植窩制備后注入，并迅速植入種植體；第三組將殼聚糖凝膠凝固后置入種植窩。觀察2h內(nèi)實驗用兔反應(yīng)。(2)用自體PB-MSCs與E+I配制的殼聚糖凝膠構(gòu)建可注射組織工程骨。所用種植體為BAM表面羥基磷灰石涂層的圓柱狀無

13、螺紋種植體，植入股骨干骺端。12只骨質(zhì)疏松兔分為3組，每組4只?？瞻讓φ战M單純植入種植體；對照組種植體骨內(nèi)周圍及骨外懸空部分應(yīng)用殼聚糖凝膠；實驗組種植體骨內(nèi)周圍及骨外懸空部分應(yīng)用可注射組織工程骨。術(shù)后10w處死所有骨質(zhì)疏松兔取材，觀察種植體懸空部分周圍新骨形成情況。X片觀察種植體骨內(nèi)部分近心端的X線阻射情況。
　　 結(jié)果：(1)所有第一組新西蘭兔在殼聚糖凝膠注射后10-30min內(nèi)死亡。第二組、第三組新西蘭兔無死亡.(2)空白對

14、照組與大部分對照組種植體懸空部分周圍無骨組織；實驗組種植體懸空部分周圍有不同程度的新生骨組織形成并與種植體緊密相接?？瞻讓φ战M種植體近心端無X線阻射影；對照組部分標(biāo)本種植體近心端有少量模糊的白色阻射影；實驗組在種植體近心端有較強條紋狀或蜂窩狀的白色阻射影，提示有較多骨形成。
　　 結(jié)論：在生理條件下可以自發(fā)凝固的可注射凝膠直接注射入封閉的骨組織內(nèi)有很高的風(fēng)險?？勺⑸浣M織工程骨既能在種植體骨外懸空部分周圍形成新生骨組織，也能在種植