新型可注射、可降解、抗骨質(zhì)疏松多功能骨水泥的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的：通過(guò)將SIM-PLLA載藥微球與CPC混合，優(yōu)化最佳材料復(fù)合比，構(gòu)建一種新型SIM-PLLA-CPC多功能骨水泥材料，并通過(guò)材料學(xué)研究、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)等方面對(duì)多功能骨水泥材料進(jìn)行評(píng)估，為骨質(zhì)疏松椎體壓縮骨折的臨床治療提供又一選擇。
　　方法：1、SIM-PLLA微球的制備:通過(guò)快速膜乳化法制備微球;
　　2、多功能骨水泥的制備:分別制備含載藥PLLA微球質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0％、5％和10％磷酸鈣骨水泥粉末:分別為對(duì)照

2、組（單純CPC組）、SIM-PLLA-CPC低劑量組及SIM-PLLA-CPC高劑量組，用物理共混的方法載藥SIM-PLLA微球與CPC固相粉劑混合，對(duì)照組不加入載藥微球，獲得多功能骨水泥粉劑;
　　3、通過(guò)SEM觀察SIM-PLLA微球的表征;
　　4、SIM-PLLA微球的包封率及載藥率測(cè)量:取微球溶解進(jìn)行紫外測(cè)量，計(jì)算微球中的藥物質(zhì)量。計(jì)算包封率和載藥率。
　　5、復(fù)合骨水泥的理化性質(zhì):測(cè)定材料的可注射性、凝固時(shí)

3、間、力學(xué)強(qiáng)度、X線衍射分析及體外降解率。
　　6、SIM-PLLA微球體外藥物釋放規(guī)律檢測(cè)稱量微球到透析袋放入PBS溶液中，在37℃下釋放;觀察藥物釋放情況。
　　7、多功能骨水泥細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn):把剛出生的SD大鼠取顱骨用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)成骨細(xì)胞，接種于材料試樣表面共培養(yǎng)一定時(shí)間后，進(jìn)行電鏡觀察細(xì)胞在材料表面的粘附情況，用CCK8方法檢測(cè)復(fù)合材料對(duì)成骨細(xì)胞粘附及增殖的影響，應(yīng)用ALP試劑盒檢測(cè)材料對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響。
　

4、　8、骨質(zhì)疏松模型的構(gòu)建按張堃等的方法建立兔骨質(zhì)疏松模型，即去勢(shì)+地塞米松處理的方法。
　　9、動(dòng)物分組及動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn):將造模成功的新西蘭大耳白兔，隨機(jī)分為3組，即CPC組，SIM-PLLA-CPC低劑量組和SIM-PLLA-CPC高劑量組。取兔子股骨髁外側(cè)切口，用電鉆開出圓柱狀骨缺損，植入骨水泥材料。
　　10、Micro-CT分析:在術(shù)后4、12周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組分別隨機(jī)處死6只兔子，把股骨遠(yuǎn)端分離，Micro-CT掃描，

5、通過(guò)分析軟件得出標(biāo)本中剩余材料的體積比(RMVF)和新骨長(zhǎng)入的體積分?jǐn)?shù)(BVF)以及材料周圍骨小梁的立體測(cè)量學(xué)指標(biāo)，如骨小梁的厚度、數(shù)量及密度等。
　　結(jié)果：1、SEM下可見(jiàn)微球均勻球狀結(jié)構(gòu)，分散性好，微球間無(wú)黏連。粒徑大小均勻，表面較多褶皺。
　　2、SIM-PLLA微球的包封率及載藥率測(cè)量:計(jì)算得到SIM-PLLA微球的載藥率是9.3％，包封率是36.1％。
　　3、體外復(fù)合材料理化性質(zhì)測(cè)定。
　　3.1、可

6、注射性能、凝固時(shí)間及力學(xué)強(qiáng)度檢測(cè)。
　　3.2、X射線衍射分析(XRD):單純CPC組和SIM-PLLA-CPC組樣品的XRD譜線與標(biāo)準(zhǔn)羥基磷灰石譜線相同，兩組材料XRD主峰位于30°附近，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其它衍射峰。
　　3.3、復(fù)合SIM-PLLA骨水泥材料表征
　　SEM結(jié)果見(jiàn)復(fù)合材料表面較為致密，在放大1000倍條件下，局部可見(jiàn)70～80μm大小的孔徑，表面可見(jiàn)較多結(jié)晶體，可見(jiàn)部分微球分布，在5000倍放大條件下，可見(jiàn)

7、較多褶皺微球嵌入材料里面，均勻的在材料間分布，微球結(jié)構(gòu)保持完整視野中微球粒徑大小在1～3μm左右。
　　4、藥物釋放檢測(cè):由圖3可見(jiàn)，藥物緩釋觀察時(shí)間周期25天，SIM-PLLA微球在前5天時(shí)間里有明顯的突釋現(xiàn)象，第10天后，釋放率達(dá)51.25±4.35％，10天以后SIM-PLLA微球藥物緩釋平穩(wěn)，直到25天時(shí)達(dá)到69.75±4.79％。
　　5、CPC和SIM-PLLA-CPC材料表面成骨細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)
　　在培養(yǎng)4

8、h后，各組的粘附性均無(wú)差異（P＞0.05），隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，低、高劑量SIM-PLLA-CPC組細(xì)胞的黏附性提高，并與單純CPC比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＜0.05，高劑量SIM-PLLA-CPC組OD值比低劑量組高，但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05，細(xì)胞在材料表面培養(yǎng)12h后，低、高劑量SIM-PLLA-CPC組黏附性指標(biāo)更高，與單純CPC材料比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＜0.05。
　　6、CPC和SIM-PLLA-CPC材料表面成骨細(xì)胞增

9、殖實(shí)驗(yàn):在1、3、5、7天時(shí)CCK-8方法所測(cè)得的吸光度值，在第1天時(shí)，低、高劑量SIM-PLLA-CPC組比單純CPC組OD值更高，但只有高劑量組與單純CPC組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＜0.05，培養(yǎng)的第3天，兩組SIM-PLLA-CPC均比CPC高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OD值隨SIM-PLLA-CPC微球含量的增高而增高，說(shuō)明載藥微球?qū)?xì)胞無(wú)毒副作用，生物相容性好，并表現(xiàn)出與SIM劑量相關(guān)的活性。
　　7、CPC和SIM-PLLA-CPC

10、材料表面成骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn):單純CPC和低、高劑量SIM-PLLA-CPC材料表面接種細(xì)胞后7天檢測(cè)ALP活性結(jié)果，可見(jiàn)含高劑量SIM組ALP活性比單純CPC和低劑量組高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05，低劑量SIM-PLLA-CPC酶活性比單純CPC的高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞0.05。
　　8、Micro-CT分析結(jié)果:單純CPC組RMVF從4w的91.6±0.13％到12w的84.32±2.03，而高劑量材料組從4w的84.5±0

11、.73％到12w時(shí)的75.6±2.11％，說(shuō)明高劑量組材料的降解速度明顯快于單純CPC組(P＜0.05)，而低劑量組材料降解速度介于單純CPC和高劑量組之間(P＜0.05)，說(shuō)明不同劑量載藥微球?qū)Σ牧辖到馑俣扔袆┝肯嚓P(guān)性。新骨長(zhǎng)入的體積分?jǐn)?shù)(BVF)，各組材料均有隨時(shí)間推移，新骨生成率增加的趨勢(shì)，其中高劑量SIM-PLLA-CPC組新骨生成速度最快，在12w時(shí)達(dá)到了17.8±1.49％，遠(yuǎn)大于單純CPC的9.72±0.75％(P＜0.0

12、5)。而低劑量組材料中新骨生長(zhǎng)速度介于單純CPC和高劑量組之間(P＜0.05)，并且低劑量組和高劑量組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，說(shuō)明不同劑量載藥微球?qū)Σ牧洗龠M(jìn)骨生長(zhǎng)速度有劑量相關(guān)性。
　　Micro-CT三維重建圖及截面重建圖:可見(jiàn)三組材料均出現(xiàn)隨4w、12w時(shí)間推移材料進(jìn)一步降解，新生骨逐漸長(zhǎng)入的情況。單純CPC組材料三維重建及橫截面4w與12w的影像圖無(wú)明顯改變，低劑量SIM-PLLA-CPC組12w的材料與4w比較

13、，材料隨時(shí)間推移降解明顯，4w時(shí)可見(jiàn)新生骨呈星點(diǎn)狀生長(zhǎng)，12w時(shí)復(fù)合材料進(jìn)一步降解，材料降解出來(lái)的空間有新骨長(zhǎng)入內(nèi)部。高劑量組與低劑量組材料比較，上述隨時(shí)間變化的趨勢(shì)更加明顯，三維重建可見(jiàn)材料12w時(shí)已經(jīng)呈疏松多孔結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)高劑量組材料周邊與骨組織切合緊密，新生成的骨組織由周邊往材料深面生長(zhǎng)，新骨長(zhǎng)入范圍也更廣。
　　植入材料術(shù)后4w時(shí)材料周圍的骨小梁參數(shù)，可以看出各組差異不顯著P＞0.05，僅僅高劑量SIM-PLLA-CPC組骨

14、小梁數(shù)量1.95±0.18 mm-1，高于其它兩組P＜0.05;表X2顯示12周時(shí)情況，12w時(shí)高劑量組（BV/TV）、Tb.N、Tb.Sp均比單純CPC組有改善(P＜0.05)，12w時(shí)CPC組各參數(shù)BV/TV、Tb.N還比4w時(shí)指標(biāo)下降了，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。而高劑量組各指標(biāo)均比4w時(shí)有所改善。
　　結(jié)論：1)通過(guò)快速膜乳化法成制作載藥微球SIM-PLLA，粒徑大小為（1.63±0.54）μm，表面褶皺，球型飽滿。

15、
　　2)復(fù)合SIM-PLLA微球的SIM-PLLA-CPC材料表面較為緊密，SIM-PLLA微球均勻分布在材料內(nèi)部，XRD反映材料結(jié)晶仍主要為羥基磷灰石，表面SIM-PLLA微球?qū)ψ怨袒^(guò)程無(wú)明顯干擾，復(fù)合材料在注射性能、凝固時(shí)間、力學(xué)性能等方面無(wú)明顯差異;
　　3)體外緩釋方面，藥物緩釋觀察時(shí)間周期25天，SIM-PLLA微球在前5天時(shí)間里有明顯的突釋現(xiàn)象，第10天后，釋放率達(dá)51.25±4.35％，10天以后SIM-P

16、LLA微球藥物緩釋平穩(wěn)，直到25天時(shí)達(dá)到69.75±4.79％。
　　4)SIM-PLLA-CPC復(fù)合材料可促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附、增殖及分化，有一定的劑量相關(guān)性，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)復(fù)合材料也有與單純CPC或PLLA材料相媲美的生物相容性，并且具有更強(qiáng)的促骨代謝作用。
　　5)SIM-PLLA-CPC復(fù)合材料1個(gè)月的體外PH值變化穩(wěn)定，與單純CPC組比較無(wú)差異，說(shuō)明PLLA與CPC復(fù)合可抑制PLLA降解產(chǎn)酸造成的PH值明顯降低效應(yīng)

17、。
　　6)SIM-PLLA-CPC復(fù)合材料在骨質(zhì)疏松兔股骨髁缺損部具有合適的力學(xué)強(qiáng)度、中后期更高的材料降解率及新骨生成率;
　　7)SIM-PLLA-CPC復(fù)合材料在骨質(zhì)疏松兔模型中具有改善局部骨質(zhì)的效果，可實(shí)現(xiàn)即時(shí)力學(xué)支撐和局部抗骨質(zhì)疏松相結(jié)合;
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將SIM-PLLA微球與CPC骨水泥復(fù)合構(gòu)建的SIM-PLLA-CPC復(fù)合骨水泥材料具有良好的生物相容性好、可注射性能及合適的力學(xué)強(qiáng)度，對(duì)兔骨質(zhì)疏