可注射型抗感染組織工程骨治療兔脛骨感染性骨缺損研究.pdf

1、背景和目的：慢性骨髓炎的治療是骨科臨床中治療的難點。這主要是因為：骨感染發(fā)展成慢性感染后，骨組織及鄰近的軟組織破壞嚴重，局部血運差，目前常規(guī)的全身應(yīng)用抗生素很難在感染局部達到有效的治療濃度，導(dǎo)致致病菌難以被殺滅；此外，慢性骨髓炎對骨組織破壞嚴重，導(dǎo)致骨質(zhì)硬化和死骨形成，清創(chuàng)后局部殘留巨大的骨組織空腔，由于一期植骨并發(fā)再次骨感染而導(dǎo)致移植失敗發(fā)生率高，目前大多選擇二期植骨，這樣就延長了治療時間，增加了患者的痛苦。但是，伴隨著抗生素局部緩釋

2、技術(shù)和骨組織工程技術(shù)的快速發(fā)展，給慢性骨髓炎這一古老而又棘手的疾病的救治帶來了新的希望。我們期望通過以纖維蛋白膠為支架的、復(fù)合萬古霉素藻酸鹽緩釋系統(tǒng)的可注射型組織工程骨來實現(xiàn)在局部的抗感染和促進成骨，從而實現(xiàn)慢性骨髓炎的徹底治愈。為此，本研究主要目的包括：(1)制備兔慢性骨髓炎模型；(2) 檢驗以纖維蛋白膠為支架的、復(fù)合萬古霉素藻酸鹽緩釋系統(tǒng)的可注射型組織工程骨的體外生物學特性；(3)利用已建立的慢性骨髓炎模型檢測以纖維蛋白膠為支架的、

3、復(fù)合萬古霉素藻酸鹽緩釋系統(tǒng)的可注射型組織工程骨體內(nèi)的治療感染和成骨能力。
　　 方法：(1)通過微創(chuàng)的骨髓穿刺針方法制備兔慢性骨髓炎模型，并通過放射影像學、組織病理學和細菌學等方法評價骨髓炎模型的科學性和穩(wěn)定性。(2)通過密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離、純化、獲得兔骨髓間充質(zhì)干細胞，通過成骨、成軟骨以及成脂肪誘導(dǎo)分化檢測其多方向分化潛能并實現(xiàn)其鑒定。(3)將兔骨髓間充質(zhì)干細胞通過逆轉(zhuǎn)錄病毒pLEGFP-N1標記后，在激光共聚焦下

4、觀察標記了增強型綠色熒光蛋白的間充質(zhì)干細胞在可注射支架纖維蛋白膠中的分布情況，通過生長曲線和堿性磷酸酶的檢測評價種子細胞間充質(zhì)干細胞在復(fù)合物中的增殖和成骨分化情況。(4)通過已構(gòu)建的兔脛骨慢性骨髓炎模型檢驗復(fù)合萬古霉素藻酸鹽緩釋系統(tǒng)的以纖維蛋白膠為支架的可注射型抗感染組織工程骨在局部的抗感染和成骨能力。再將構(gòu)建好的慢性骨髓炎模型感染部位行徹底清創(chuàng)術(shù)之后，將可注射型抗感染組織工程骨移植到脛骨干骺端骨缺損處，通過放射影像學、組織病理學和細菌

5、學檢測可注射型抗感染組織工程骨在體內(nèi)的抗感染能力和局部成骨能力。結(jié)果：(1)通過微創(chuàng)的骨髓穿刺針方法建立兔慢性骨髓炎模型，術(shù)后4周影像學顯示，有明顯的慢性骨髓炎的X 線表現(xiàn)：軟組織炎癥反應(yīng)，死骨形成，骨硬化，骨膜反應(yīng)，其X 線Norden 骨髓炎評分顯示，最高分5分，最低分2分，平均值±標準差為3.6±0.8。組織病理學顯示存在伴有明顯骨吸收和死骨形成的化膿性病灶。細菌學結(jié)果提示每只動物近端、中段、遠端的骨組織內(nèi)均培養(yǎng)出ATCC 259

6、23 金黃色葡萄球菌，標本細菌計數(shù)的均值為(6.8±0.2)×109 CFU/g。(2)通過密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離、純化、獲得了兔骨髓間充質(zhì)干細胞，通過成骨、成軟骨以及成脂肪誘導(dǎo)液誘導(dǎo)21天后經(jīng)過骨鈣素免疫組化染色以及茜素紅和von Kossa 病理染色證實分化為成骨細胞，通過Ⅱ型膠原免疫組化染色證實分化為軟骨細胞，通過油紅O 染色證實分化為脂肪細胞。(3)用逆轉(zhuǎn)錄病毒pLEGFP-N1成功標記兔骨髓間充質(zhì)干細胞，在激光共聚焦下

7、觀察標記了增強型綠色熒光蛋白的間充質(zhì)干細胞在可注射支架纖維蛋白膠中的均勻分布，生長曲線和堿性磷酸蛋白酶的檢測結(jié)果顯示種子細胞間充質(zhì)干細胞可在復(fù)合物中很好的增殖和成骨分化。(4)以纖維蛋白膠為支架的復(fù)合萬古霉素藻酸鹽緩釋系統(tǒng)的可注射型抗感染組織工程骨移植慢性骨髓炎骨缺損模型的感染部位之后，放射影像學和組織病理學顯示復(fù)合物可以有效的控制感染，術(shù)后3月無明顯的感染病灶存在，同時新生的骨小梁較對照組明顯；細菌學檢測顯示實驗組的標本內(nèi)的每克組織內(nèi)

8、的細菌數(shù)較未放置萬古霉素緩釋微球的對照組而言顯著減少(p<0.05)。
　　 結(jié)論：(1)通過改良的方法成功制備了兔慢性骨髓炎模型，降低了感染的不穩(wěn)定率及動物的死亡率，該模型具有穩(wěn)定、科學、重復(fù)性好的特點；(2)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的增強型綠色熒光蛋白(EGFP)成功感染間充質(zhì)干細胞(BMSCs)，激光共聚焦顯微鏡下顯示種子細胞在支架內(nèi)均勻分布；(3)生長曲線和堿性磷酸酶的檢測顯示在復(fù)合物內(nèi)種子細胞可以很好地增殖和成骨分化；(4)以纖