3D打印β-TCP骨組織工程支架負(fù)載異煙肼、利福平-PLGA緩釋微球治療感染性骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：對(duì)3D打印β-磷酸三鈣骨組織工程支架負(fù)載異煙肼、利福平/PLGA緩釋微球特征、相關(guān)力學(xué)性能檢測(cè)及體內(nèi)外抗菌能力進(jìn)行研究。建立兔股骨髁慢性骨髓炎模型，并將復(fù)合材料一期置入骨缺損處，觀察其治療效果。創(chuàng)造一種新的治療感染性骨缺損的骨替代材料，這種材料既有較好的局部抗菌能力，又同時(shí)可以誘導(dǎo)骨的生長(zhǎng)。本研究旨在為慢性骨髓炎的治療尋找一種全新的治療方法，同時(shí)也為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)由三部分組成
　　1、3D打印

2、β-磷酸三鈣骨組織工程支架負(fù)載異煙肼、利福平/PLGA緩釋微球的制備、特征、相關(guān)力學(xué)性能檢測(cè)及體外抗菌能力研究
　　通過(guò)復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備異煙肼、利福平/PLGA緩釋微球；采用CAD軟件設(shè)計(jì)多孔β-磷酸三鈣支架模型，通過(guò)3D-Bioplotter打印機(jī)制備出多孔β-磷酸三鈣支架；最后采用離心震蕩的方式將緩釋微球載入多孔β-磷酸三鈣支架，制備成復(fù)合材料。通過(guò)大體觀察、光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡檢測(cè)復(fù)合材料的表面情況、孔隙率及微球與支架之間

3、的融合情況；采用抗壓強(qiáng)度測(cè)試復(fù)合材料的抗壓能力；采用抑菌環(huán)試驗(yàn)、菌落數(shù)試驗(yàn)檢測(cè)復(fù)合材料體外抗菌能力。
　　2、兔股骨髁慢性骨髓炎模型的構(gòu)建及相關(guān)評(píng)價(jià)
　　在兔股骨髁外側(cè)打孔，注入5％的魚(yú)肝油酸鈉使局部血管閉塞壞死，而后注入MRSA菌誘導(dǎo)產(chǎn)生慢性骨髓炎模型。進(jìn)一步探究細(xì)菌濃度與慢性骨髓炎之間的關(guān)系，總結(jié)出最適合的濃度，為以后的實(shí)驗(yàn)提供較理想的動(dòng)物模型。
　　3、3D打印支架負(fù)載緩釋微球治療兔股骨髁慢性骨髓炎的實(shí)驗(yàn)研究

4、r>　　成功建立好股骨髁慢性骨髓炎模型后，對(duì)病灶進(jìn)行徹底外科清創(chuàng)。實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為單純清創(chuàng)組、緩釋微球組、支架組、復(fù)合材料組、空白對(duì)照組。分別于4w、8w、12w進(jìn)行大體觀察、放射學(xué)、組織病理學(xué)、免疫組化及細(xì)菌培養(yǎng)觀察材料的局部抗菌效果；再通過(guò)放射學(xué)、MicroCT、免疫組化、PCR觀察材料在局部的成骨效果。
　　結(jié)果：1、3D打印β-磷酸三鈣骨組織工程支架負(fù)載異煙肼、利福平/PLGA緩釋微球的特征、相關(guān)力學(xué)性能檢測(cè)及體外抗菌

5、能力
　　通過(guò)掃描電鏡觀察到支架孔徑大小400μm左右，重量體積法測(cè)定孔隙率為(66.34±2.76)%；抗壓強(qiáng)度測(cè)試測(cè)定材料的最大負(fù)荷和強(qiáng)度為114.5±13.8N和5.8±0.7MPa，符合人類松質(zhì)骨壓縮強(qiáng)度（2-12Mpa）。抑菌實(shí)驗(yàn)表明，復(fù)合材料對(duì)MRSA有明顯的抗菌能力。
　　2、兔股骨髁慢性骨髓炎模型的構(gòu)建及相關(guān)評(píng)價(jià)
　　動(dòng)物分為5組，分別注入A0組（0.1ml生理鹽水）、A1(0.1ml10×106CFU

6、/mlMRSA菌)、A2(0.1ml10×107CFU/mlMRSA菌)、A3(0.1ml10×108CFU/mlMRSA菌)、A4(0.1ml10×109CFU/mlMRSA菌)。術(shù)后1w除A0組外各組動(dòng)物手術(shù)部位均出現(xiàn)竇道、流膿和局部腫脹現(xiàn)象；術(shù)后4w影像學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)除A0組均有局部軟組織腫脹，骨皮質(zhì)變薄，骨小梁數(shù)目減少，骨質(zhì)硬化，骨質(zhì)溶解，死骨形成等慢性骨髓炎表現(xiàn)。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，取局部組織行細(xì)菌培養(yǎng)，菌落生長(zhǎng)良好，

7、證實(shí)為MRSA菌。對(duì)骨髓炎模型進(jìn)行分級(jí)（采用兔金黃色葡萄球菌骨髓炎模型嚴(yán)重程度分級(jí)）：A1組為0級(jí)；A2組為1級(jí)；A3組為2～3級(jí)；A4組為3～4級(jí)。
　　3、3D打印支架負(fù)載緩釋微球治療兔股骨髁慢性骨髓炎
　　成功構(gòu)建慢性骨髓炎動(dòng)物模型后，將復(fù)合材料植入動(dòng)物骨缺損部位，通過(guò)大體觀察、放射學(xué)、組織病理學(xué)、免疫組化、MicroCT、PCR等檢查發(fā)現(xiàn)只有復(fù)合材料組能有效控制慢性骨髓炎的局部炎癥，并且有明顯的成骨作用；影像學(xué)觀察發(fā)

8、現(xiàn)炎癥逐漸減輕，骨皮質(zhì)在材料的作用下開(kāi)始變連續(xù)，12w后材料開(kāi)始快速分解，骨質(zhì)通過(guò)孔徑長(zhǎng)入；免疫組化發(fā)現(xiàn)在新生骨周圍有大量BMP-2表達(dá)，PCR見(jiàn)1型和2型膠原大量表達(dá)。其余各組炎癥控制及成骨作用均較差。
　　結(jié)論：3D打印β-磷酸三鈣骨組織工程支架負(fù)載異煙肼、利福平/PLGA緩釋微球在治療慢性骨髓炎方面具有良好的效果，不僅有滿意的生物相容性和力學(xué)強(qiáng)度，而且在局部抗菌和成骨方面具有較大優(yōu)勢(shì)。在未來(lái)骨髓炎的臨床治療方面，該實(shí)驗(yàn)提供了