同種異體PRP應(yīng)用于骨組織工程的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1.觀察同種異體PRP釋放物對(duì)體外培養(yǎng)的BMSCs增殖的影響。研究PRP促進(jìn)BMSCs增殖與分化的量效關(guān)系，探索用于細(xì)胞培養(yǎng)及組織工程骨構(gòu)建的最佳PRP濃度。 2.研究觀察同種異體PRP凝膠用作骨植入物的免疫排斥反應(yīng)，探討同種異體PRP用于骨再生醫(yī)學(xué)的可行性，為同種異體PRP凝膠用于臨床骨修復(fù)提供基礎(chǔ)。 3.驗(yàn)證同種異體PRP凝膠構(gòu)建骨修復(fù)材料及組織工程骨修復(fù)骨缺損的效果，初步探討PRP促進(jìn)骨再生的機(jī)制。

2、 方法： 1.以新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，取心臟血提取PRP，分別檢測(cè)PRP及全血中血小板數(shù)。無(wú)菌條件下抽取兔髂骨髓體外培養(yǎng)兔BMSCs，以培養(yǎng)的第3代BMSCs用于實(shí)驗(yàn)，分別以含自體與同種異體10％PRP萃取液的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞分為自體PRP組、異體PRP組。倒置相差顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，于體外培養(yǎng)1，3，6天MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)，評(píng)價(jià)同種異體PRP對(duì)BMSCs增殖的影響。 2.取第3代體外培養(yǎng)的兔B

3、MSCs，分別配制含不同濃度同種異體PRP萃取液(1％、2.5％、5％、7.5％、lO％、15％、20％、30％、50％)的DMEM培養(yǎng)基，以不含PRP培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為含10％FBS的培養(yǎng)基。以各培養(yǎng)基體外培養(yǎng)BMSCs分別于培養(yǎng)3，6，9天進(jìn)行MTT檢測(cè)，研究PRP對(duì)BMSCs增殖影響的量效關(guān)系。從堿性磷酸酶活性測(cè)定，堿性磷酸酶染色、鈣沉積染色評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)不同濃度的PRP對(duì)MSCs的成骨分化的誘導(dǎo)作用。 3.新西蘭大

4、白兔12只，共分為A、B兩組，A組4只，B組8只。A組為同種異體PRP凝膠肌內(nèi)注射組，A組動(dòng)物于雙側(cè)臀大肌內(nèi)注射同種異體PRP凝膠各1.0ml，B組為骨缺損動(dòng)物模型組，8只動(dòng)物隨機(jī)分為B1、B2兩組，每組4只，制作右橈骨缺損1.5cm模型，B1組以同種異體PRP凝膠+植骨材料修復(fù)骨缺損，B2組為單純植骨材料修復(fù)組。兩組動(dòng)物分別于處理(肌注同種異體PRP凝膠或植入異體PRP凝膠復(fù)合材料)前3天，處理后1、4、12周后觀察一般情況，傷口愈合

5、情況，并抽外周血以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4、CD8淋巴細(xì)胞亞群，局部組織學(xué)觀察及免疫組織化學(xué)染色檢查，評(píng)價(jià)同種異體PRP凝膠用作植骨材料局部應(yīng)用的免疫反應(yīng)。 4.制備兔橈骨骨與骨膜缺損1.5cm骨缺損動(dòng)物模型。24只新西蘭兔隨機(jī)分為A，B組，每組12只。各組雙前肢骨缺損分別以四種植骨材料修復(fù)：A組分兩個(gè)亞組。左側(cè)橈骨缺損處植入體外培養(yǎng)的BMSCs與脫蛋白骨支架構(gòu)建的組織工程骨(DPB+BMSCs)材料，記為A1組。右側(cè)為PRP復(fù)合D

6、PB+BMSCs構(gòu)建的組織工程骨(PRP+DPB+BMSCs)，為A2組；B組左側(cè)橈骨缺損處植入單純脫蛋白骨(DPB)材料，為B1組；右側(cè)為PRP復(fù)合脫蛋白骨(PRP+DPB)，即B2組。術(shù)后觀察一般情況，傷口愈合等，于4、8、12W每組隨機(jī)取4只活體檢測(cè)骨缺損區(qū)骨密度，ECT檢查ROI平均計(jì)數(shù)，于各時(shí)間點(diǎn)分別處死4只動(dòng)物取出骨缺損區(qū)標(biāo)本進(jìn)行大體觀察，X線照片和組織學(xué)切片觀察，圖像分析軟件計(jì)算骨缺損區(qū)域成骨面積，評(píng)價(jià)同種異體PRP凝膠復(fù)

7、合材料對(duì)骨再生的影響。 結(jié)果： 1.所制備的PRP中血小板數(shù)為全血中4.12倍。同種異體PRP培養(yǎng)組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞形態(tài)正常，與自體PRP培養(yǎng)組無(wú)明顯差異。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組D570值逐漸增加(F=128.197，P=0.000)。兩組間于培養(yǎng)1，3，6天各時(shí)間點(diǎn)OD570無(wú)顯著性差異(相應(yīng)的t=0.090，-0.109，0.175，P值分別為P=0.93、0.916、0.865)。 2.在觀察期內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)

8、組與陰性對(duì)照組相比，1％濃度組無(wú)明顯促細(xì)胞增殖作用(P=0.814)，而其他各組(2.5％、5％、7.5％、10％、15％、20％、30％、50％)OD570值與陰性對(duì)照組相比，均有顯著性增高(P<0.01)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，1％，2.5％兩組OD570值均明顯較低，其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，5％，7.5％組OD570與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著性差別(P值分別為0.093，0.753)。 3.各組間ALP差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

9、F=15.709，P=0.000)。各時(shí)間點(diǎn)間ALP活性差別也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=89.244，P=0.000)。 4.一般情況觀察肌內(nèi)注射及手術(shù)植入同種異體PRP凝膠后未見(jiàn)動(dòng)物有發(fā)熱，皮下淤血、傷口滲液，延遲愈合等現(xiàn)象。淋巴細(xì)胞亞群監(jiān)測(cè)結(jié)果：肌內(nèi)注射同種異體PRP凝膠后不同時(shí)間點(diǎn)間CD4、CD8淋巴細(xì)胞數(shù)與注射前相比有輕度升高，CD4/CD8稍降低，但其差異均無(wú)顯著性意義(P>0.05). 5.骨缺損修復(fù)術(shù)后所有動(dòng)物無(wú)明

10、顯并發(fā)癥。從大體標(biāo)本及X線片觀察術(shù)后4、8周時(shí)A2、B2組骨缺損處骨愈合情況及骨痂生成明顯優(yōu)于A1，B1組。 結(jié)論： 1.同種異體PRP對(duì)BMSCs增殖的影響與自體PRP無(wú)明顯差別。PRP對(duì)體外培養(yǎng)BMSCs增殖影響存在較復(fù)雜的量效關(guān)系，在一定濃度范圍內(nèi)隨PRP濃度的增加，其促細(xì)胞增殖作用更明顯，但隨濃度的增高，其促細(xì)胞增殖活力下降。其促進(jìn)BMSCs向成骨分化的能力依賴于作用時(shí)間，長(zhǎng)期低濃度PRP有利于促進(jìn)BMSCs向成