鐮刀菌和黃曲霉菌生防菌的分離及拮抗機(jī)理研究.pdf

1、鐮刀菌和黃曲霉菌是世界上侵染小麥、玉米、水稻、花生等多種糧食和油料作物的病原真菌，不僅降低作物品質(zhì)和產(chǎn)量，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還在侵染植物過程中產(chǎn)生多種真菌毒素，人、畜誤食后會(huì)引起中毒，嚴(yán)重時(shí)可致癌癥和死亡。中國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，糧食的生產(chǎn)和品質(zhì)關(guān)系著國(guó)家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定。因此，開展鐮刀菌和黃曲霉菌控制技術(shù)研究，對(duì)于保障我國(guó)糧食穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)和食品安全，具有重要意義。
　　由于天然抗性資源匱乏，已鑒定和開發(fā)的抗病資源有限，傳統(tǒng)育種方法未能

2、有效控制這些病原菌及其毒素的危害。長(zhǎng)期以來(lái)，鐮刀菌和黃曲霉菌的防治以化學(xué)殺菌劑為主，導(dǎo)致了嚴(yán)重的環(huán)境污染和生態(tài)環(huán)境問題，誘發(fā)了病原菌的抗藥性和產(chǎn)毒量的增強(qiáng)。所以，開發(fā)對(duì)生態(tài)和環(huán)境安全的生物防治技術(shù)，具有廣泛的應(yīng)用前景。為此，我們分別以禾谷鐮刀菌和黃曲霉菌為靶標(biāo)病原真菌，通過微生物源生防菌株的分離、篩選、代謝物解析以及作用機(jī)理研究，獲得多個(gè)高活性拮抗菌，鑒定了主要抑菌物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用靶點(diǎn)，并用于田間及儲(chǔ)藏期的病原菌防治。
　　以

3、鐮刀菌為靶標(biāo)病原菌取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.抑制鐮刀菌的芽孢桿菌篩選。從中國(guó)9個(gè)省的不同生態(tài)環(huán)境中采集樣品160份，分離得到1809個(gè)菌株，其中12個(gè)菌株能顯著抑制禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)，進(jìn)一步用于孢子萌發(fā)、苗期接種、田間單花接種和噴霧接種等拮抗作用分析，最終獲得具有高效抑菌活性的3株芽孢桿菌(S76-3，DM-3，DK-1)，其孢子萌發(fā)抑制率97％，小麥苗腐病抑制率為46％-57％，小麥穗腐病的抑制率為67％-80％。篩選得到的

4、高效菌株S76-3用于鐮刀菌的田間防治和抑菌機(jī)理研究;
　　2.拮抗菌及其無(wú)菌上清液抑菌活性測(cè)定。以抑菌活性最強(qiáng)的解淀粉芽孢桿菌S76-3為材料，以活菌數(shù)為指標(biāo)優(yōu)化發(fā)酵條件，篩選得到一個(gè)最優(yōu)培養(yǎng)基（紅糖23.3g/L，豆粉11.1g/L, CaCO34.9g/L, KNO38g/L, KH2PO40.5g/L, K2HPO41.2g/L,MgSO4·7H2O5g/L，NaC13g/L)，發(fā)酵后活菌數(shù)達(dá)1010/ml以上;收集發(fā)酵液

5、菌體，添加助劑后制備可濕性粉劑，活菌數(shù)達(dá)109/g以上。S76-3可濕性粉劑與無(wú)菌上清液稀釋后的田間試驗(yàn)表明，S76-3菌體和無(wú)菌上清液在不同年份和品種中均可有效防治小麥赤霉病，以2013年為例，無(wú)菌上清液處理后的病情指數(shù)可降低52％，小麥籽粒毒素含量降低76％，顯著優(yōu)于常用化學(xué)殺菌劑多菌靈;S76-3菌體處理可降低13％的病情指數(shù)的，43％的毒素，明顯弱于多菌靈;
　　3.抑菌物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)解析。S76-3菌株基因組測(cè)序結(jié)合PCR

6、分析表明，該菌株含有脂肽類物質(zhì)編碼基因;薄層色譜和液相色譜質(zhì)譜連用儀分析證實(shí)，S76-3菌株主要產(chǎn)生依枯草菌素、豐原素和表面活性素;進(jìn)一步將這3種物質(zhì)經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離和質(zhì)譜分析(ESI-CID-MS)表明，S76-3產(chǎn)生的脂肽物質(zhì)為依枯草菌素A、豐原素A/B和表面活性素，每類物質(zhì)分別含有2-4種同系物;
　　4.脂肽類物質(zhì)抑菌機(jī)理。利用高效液相收集上述3種脂肽物質(zhì)，配置成不同濃度后用于體外抑制鐮刀菌活性以及抑菌機(jī)理研究，結(jié)果表明，表

7、面活性素不具有抑菌活性，依枯草菌素A和豐原素A可高效抑菌鐮刀菌;光學(xué)顯微鏡分析表明，這2種物質(zhì)均可破壞鐮刀菌菌絲和孢子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致真菌細(xì)胞膨大后喪失活性;透射電鏡分析顯示，這2種物質(zhì)主要引起真菌細(xì)胞壁穿孔和細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡;實(shí)時(shí)顯微跟蹤分析表明，依枯草菌素A主要作用于真菌菌絲的側(cè)端導(dǎo)致凸起，豐原素主要作用于菌絲生長(zhǎng)點(diǎn)，使其異常膨大。
　　以黃曲霉菌為靶標(biāo)病原菌取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.產(chǎn)氣拮抗菌篩選與鑒定。從1

8、00余株海洋細(xì)菌中，通過雙皿對(duì)扣抑菌試驗(yàn)，篩選獲得可產(chǎn)生抑菌性揮發(fā)氣體、對(duì)黃曲霉菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制率高于80％的細(xì)菌5株，包括1株假單胞菌（Pseudomonas sp.）、1株希瓦氏菌YM8（Shewanella sp.）、2株葡萄球菌（Staphylococcus sp.）和1株微球菌（Micrococcus sp.），其中海藻希瓦氏菌YM8的抑菌活性最強(qiáng)，對(duì)黃曲霉菌、鐮刀菌等9種重要植物病原真菌的抑制率均為100％。以海藻

9、希瓦氏菌YM8為材料進(jìn)行儲(chǔ)藏期黃曲霉菌及其毒素防治和抑菌機(jī)理研究;
　　2.抑菌氣體的化學(xué)結(jié)構(gòu)解析。利用氣相色譜質(zhì)譜連用儀(GC-MS)對(duì)YM8產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，YM8可產(chǎn)生15種揮發(fā)性物質(zhì)，包括芳香族，烷類，硫化物，烯醇類，噁唑類，蒽類，酯類以及酚類等8類物質(zhì)，其中二甲基三硫豐度最高，相對(duì)含量達(dá)14.195％。從15種物質(zhì)中選取相似度高于70％，相對(duì)含量高于0.5％的6種物質(zhì)進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，2，4-

10、二叔丁基苯酚和二甲基三硫的抑菌作用最強(qiáng)，分別在濃度為100μg/L和200μg/L（物質(zhì)重量/空間體積）時(shí)可完全抑制黃曲霉菌絲的生長(zhǎng)和孢子萌發(fā);其余4種物質(zhì)，2，4-二甲基噁唑、2-十二烷醇、丁基羥基甲苯和壬烷也具有抑制黃曲霉菌的作用。其中2，4-二甲基噁唑和2-十二烷醇為首次報(bào)道對(duì)病原真菌具有抑制作用。豐度最高、抑菌活性最強(qiáng)的二甲基三硫，在YM8菌株的抑菌活性中具有重要作用;
　　3.產(chǎn)氣菌對(duì)糧食中黃曲霉抑菌效率分析。將YM8菌

11、與接種黃曲霉孢子的花生、玉米籽粒共培養(yǎng)后檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組樣品中水活度越高發(fā)病率越高，毒素含量越大。高水活度下花生樣品發(fā)病率為100％，毒素含量為54μg/g，玉米樣品發(fā)病率為100％，毒素量為5.59μg/g，與此相比，YM8菌株可完全抑制花生、玉米籽粒黃曲霉菌生長(zhǎng)和毒素合成，在3種水活度下的黃曲霉菌與產(chǎn)毒量均為0。掃描電子顯微鏡觀察，未經(jīng)YM8處理的花生，表面覆蓋大量黃曲霉菌絲和孢子;而YM8處理組的花生表面，孢子不能萌發(fā)，沒有菌

12、絲及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，少量異常孢子形狀畸形，表面干癟皺縮，失去侵染和萌發(fā)能力;
　　4.YM8序列測(cè)定及BAC文庫(kù)構(gòu)建。YM8全基因組測(cè)序結(jié)果表明，該菌株基因組大小為4-5 M bp;提取YM8菌株DNA構(gòu)建大腸桿菌BAC文庫(kù)，獲得含有1152個(gè)克?。ㄆ伍L(zhǎng)度為60 kb左右）的BAC文庫(kù)用于后續(xù)克隆二甲基三硫編碼基因。YM8菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中抑菌作用較弱，通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同氨基酸，發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸和半胱氨酸能顯著提高抑菌活性，說明這