Ntcp、Bsep、Mdr2蛋白改變致膽汁失衡在大鼠自體肝移植膽道相對熱缺血損傷中的作用機(jī)制.pdf

1、背景
　　 肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥是影響患者長期存活及導(dǎo)致移植物功能受損的最主要因?yàn)橹?因此被肝移植先驅(qū)Roy Calne稱之為“阿喀琉斯之踵”。目前以彌漫性或局灶性的移植物膽管樹狹窄、擴(kuò)張、毀損及管型形成為病理特征的缺血性膽管病變(ITBL)被認(rèn)為是非外科性移植物膽管樹損害的主要因?yàn)?。缺血再灌注損傷是供肝膽管必須經(jīng)歷的病理生理過程,也是導(dǎo)致移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的主要因?yàn)橹?。在肝移植過程中,供肝膽道需要經(jīng)歷短暫的熱缺血損傷,冷保

2、存損傷,膽道相對熱缺血損傷(又稱為膽道二次熱缺血損傷)、再灌注損傷等過程。目前肝移植膽道相對熱缺血損傷越來越受到研究者的重視,但其機(jī)制目前還不十分明了。
　　 膽鹽在膽道缺血再灌注損傷中起著重要的協(xié)同作用。已有研究證實(shí),供肝熱缺血、冷保存時(shí)間的延長都可使膽鹽比例相對增加,而具有膽道保護(hù)作用的磷脂比例相對減少。疏水性膽鹽的“去垢”作用可誘導(dǎo)正常膽道上皮細(xì)胞的死亡或凋亡。由于肝動(dòng)脈血供對移植肝膽汁分泌功能的正?；謴?fù)非常重要,因此我們

3、推測,在臨床肝移植中,如果肝動(dòng)脈開放時(shí)間延遲,那么術(shù)后早期分泌的膽汁也可能出現(xiàn)類似的變化,加重膽道損傷。
　　 鑒于此,本課題建立大鼠自體原位肝移植膽道外引流模型,分別在門靜脈開放0min、30min及60min后開放肝動(dòng)脈,造成不同程度的膽道相對熱缺血。引流術(shù)后早期分泌的膽汁,檢測其中的膽鹽、磷脂濃度及其比例,以及對膽汁影響較大的親水性膽鹽及疏水性膽鹽的摩爾分?jǐn)?shù),以探討膽道相對熱缺血是否會(huì)引起術(shù)后早期膽汁成分的失衡,以及這種膽

4、汁是否會(huì)導(dǎo)致或加重膽道損傷。膽鹽及磷脂的分泌依賴于肝細(xì)胞膜上的肝膽膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ntcp、Bsep、Mdr2,因此我們還檢測了這三種蛋白在肝組織中的表達(dá)情況,以求初步探討膽道相對熱缺血引起膽汁失衡的機(jī)理。
　　 第一部分 大鼠自體原位肝移植膽道外引流模型的建立
　　 目的
　　 建立大鼠自體原位肝移植膽道外引流模型,要求該模型既可模擬臨床肝移植的過程,又能精確控制膽道相對熱缺血時(shí)間,還能夠引流出膽汁以便于檢測膽汁成分

5、的變化。
　　 方法
　　 選用8周齡健康、SPF級(jí)純系SD大鼠35只,雌雄不限,體重280～300g。實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)階段進(jìn)行,其中預(yù)實(shí)驗(yàn)15例,系手術(shù)技巧及方法的練習(xí)；正式實(shí)驗(yàn)20例。手術(shù)操作步驟如下:①游離肝臟周圍韌帶、肝上、肝下下腔靜脈,門靜脈、肝動(dòng)脈及肝外膽道。②穿刺門靜脈并肝素化。③使用4℃含肝素(12.5U/ml)的乳酸鈉林格氏液行腹主動(dòng)脈及門靜脈雙重恒壓冷灌注。④灌注滿意后,修補(bǔ)門靜脈、腹主動(dòng)脈穿刺點(diǎn)以及下腔

6、靜脈的灌注液流出通道,開放門靜脈血液灌注,結(jié)束無肝期。⑤門靜脈開放60min后恢復(fù)肝動(dòng)脈灌注。⑥建立膽道外引流通道:用兩段硬膜外導(dǎo)管進(jìn)行膽總管插管及上段空腸造瘺,兩段導(dǎo)管在體外經(jīng)軟塑料導(dǎo)管相連接,建立膽汁回流通路。
　　 結(jié)果
　　 1.在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,手術(shù)成功率為66.7％(10/15),5天存活率為53.3％(8/15)；在正式實(shí)驗(yàn)中,手術(shù)成功率95％(19/20),術(shù)后5天存活率為85％(17/20)。
　　

7、2.在正式試驗(yàn)中,平均熱缺血時(shí)間2.756±0.204min,冷灌注時(shí)間為8min,無肝期為16.200±0.630min。
　　 3.門靜脈和腹主動(dòng)脈雙重恒壓冷灌注效果好,肝臟灌注均勻；開放血流灌注后,肝臟復(fù)流良好；術(shù)后膽汁外引流通暢。
　　 4.本模型除了血管吻合外,基本模擬了肝移植的操作過程；本模型排除了排斥反應(yīng)、免疫因素等可能對膽道造成的影響,可以精確控制門靜脈及肝動(dòng)脈的開放時(shí)間。
　　 5.手術(shù)失敗的因

8、為主要包括:肝臟游離時(shí)操作不慎引起大出血或?qū)е職庑?穿刺及修補(bǔ)血管失敗,膽總管插管失敗,無肝期不耐受。術(shù)后并發(fā)癥主要有:膽總管插管刺破膽管壁所引起的膽漏,引流管牽拉導(dǎo)致膽總管扭曲、梗阻,腹腔感染。
　　 結(jié)論
　　 大鼠自體原位肝移植膽道外引流模型能夠精確控制膽道相對熱缺血時(shí)間,可隨時(shí)觀測膽汁變化而不干擾正常的膽汁酸腸肝循環(huán),是研究肝移植膽道相對熱缺血損傷及術(shù)后膽汁變化的理想模型。
　　 第二部分 膽汁成分失衡在

9、大鼠自體原位肝移植膽道相對熱缺血損傷中的作用
　　 目的
　　 檢測經(jīng)歷過不同膽道相對熱缺血時(shí)間的大鼠自體原位移植肝在術(shù)后早期分泌的膽汁中膽鹽、磷脂濃度及膽鹽/磷脂比例的變化,以及膽汁中主要親水性及疏水性膽鹽摩爾分?jǐn)?shù)的變化情況；觀察大鼠移植肝膽道損傷情況,探討膽汁成分變化與膽道損傷的相關(guān)性,從“膽汁失衡”的角度揭示肝移植膽道相對熱缺血損傷的機(jī)制。
　　 方法
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組設(shè)計(jì)
　　 8周

10、齡健康、SPF級(jí)純系SD大鼠128只,雌雄不限,體重280～300g,隨機(jī)分為4組,每組32只:Ⅰ組為假手術(shù)組,Ⅱ組為膽道相對熱缺血0min組,Ⅲ組為膽道相對熱缺血30min組；Ⅳ組為膽道相對熱缺血60min組。每一組又隨機(jī)分為4個(gè)亞組:a、b、c、d組分別在術(shù)后第0(即術(shù)后立即采集)、1、3、5天的同一時(shí)刻采集標(biāo)本。
　　 2.觀察指標(biāo)及方法
　　 (1)大鼠膽汁中總膽汁酸鹽(TBA)濃度檢測采用循環(huán)酶法,磷脂(PL)

11、濃度檢測采用酶顯色法,谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、堿性磷酸酶采用連續(xù)檢測法。
　　 (2)采用反相高效液相色譜分析檢測膽汁中親水性膽鹽TβMC、THDC及疏水性膽鹽TC、TDC的摩爾濃度,并計(jì)算四種膽鹽的摩爾分?jǐn)?shù)。
　　 (3)取肝門部膽道制作石蠟切片,HE染色,于光鏡下觀察膽道組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。參照Hertl等的方法并加以改進(jìn),對肝門部膽管損傷程度進(jìn)行分級(jí):0級(jí),膽管粘膜上皮細(xì)胞和粘膜下腺體上皮細(xì)胞正常(記0分)；1級(jí),損傷局限在

12、粘膜上皮層,膽管粘膜上皮細(xì)胞有散在性固縮、壞死、脫落,其數(shù)量不足粘膜上皮細(xì)胞總數(shù)的10％,粘膜下腺體正常(記1分)；2級(jí),10％-30％的膽管粘膜上皮細(xì)胞固縮、壞死、脫落,10％以下的粘膜下腺體上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落(記2分)；3級(jí),超過30％的膽管粘膜上皮細(xì)胞壞死、脫落,10％-30％的粘膜下腺體上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落(記3分)。
　　 (4)取肝門部膽道制作電鏡切片,在透射電鏡下觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。用Imagepro圖像

13、分析軟件進(jìn)行定量分析,求出每張照片中所有線粒體平均體積(V)-代表線粒體腫脹程度,說明線粒體受損情況；膽管上皮細(xì)胞微絨毛的面積密度(AMV)-代表膽管上皮細(xì)胞表面微絨毛的覆蓋面積,說明上皮細(xì)胞微絨毛脫落程度。
　　 (5)TUNEL法檢測肝門部膽道上皮細(xì)胞的凋亡情況。每張切片高倍光學(xué)顯微鏡下(×400)隨機(jī)選取10個(gè)視野,計(jì)算細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞總數(shù),以凋亡細(xì)胞總數(shù)/細(xì)胞總數(shù)計(jì)算出凋亡細(xì)胞百分率,作為凋亡指數(shù)(AI)。
　　

14、 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組均數(shù)間比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析,組間兩兩比較采用最小差異t檢驗(yàn)(LSD-t)或Tamhane's T2檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用雙變量相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論
　　 隨著膽道相對熱缺血時(shí)間的延長,膽汁酸鹽和磷脂分泌功能下降,且下降程度不一致,術(shù)后恢復(fù)也不同步,從而導(dǎo)致術(shù)后早期

15、膽鹽/磷脂比例升高；術(shù)后早期膽汁中疏水性膽鹽的比例也呈增高趨勢。膽汁成分失衡與膽道損傷程度密切相關(guān),是肝移植膽道相對熱缺血損傷的機(jī)制之一。
　　 第三部分 大鼠自體原位肝移植膽道相對熱缺血對肝膽膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ntcp、Bsep、Mdr2的影響
　　 目的
　　 檢測經(jīng)歷過不同膽道相對熱缺血時(shí)間的大鼠自體原位移植肝的肝膽膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ntcp、Bsep、Mdr2在肝組織中的表達(dá)水平,初步探討肝移植膽道相對熱缺血引起膽汁成分

16、失衡的機(jī)制。
　　 方 法
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組設(shè)計(jì)
　　 8周齡健康、SPF級(jí)純系SD大鼠18只,隨機(jī)分為3組,每組6只:A組為假手術(shù)組,B組為膽道相對熱缺血0min組,C組為膽道相對熱缺血60min組。在術(shù)后第3天采集肝臟標(biāo)本。
　　 2.觀察指標(biāo)及方法
　　 Western Blotting及免疫組織化學(xué)染色觀測肝臟肝膽膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ntcp、Bsep、Mdr2在組織中的表達(dá)情況。