多烯磷脂酰膽堿對(duì)大鼠肝移植術(shù)中膽道相對(duì)熱缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目前肝移植已成為治療終末期肝病的最佳手段。肝移植術(shù)后的膽道并發(fā)癥作為制約移植受體存活率和遠(yuǎn)期療效的關(guān)鍵,素來(lái)有“阿喀琉斯之踵”之稱。缺血再灌注損傷是供肝膽管必須經(jīng)歷的病理生理過(guò)程,也是導(dǎo)致移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的主要因?yàn)橹弧Ｒ浦哺文懝芤?jīng)歷短暫的熱缺血、冷保存損傷、相對(duì)熱缺血再灌注損傷、再灌注損傷。其造成膽道損傷的機(jī)理可能包括細(xì)胞線粒體呼吸功能喪失以及繼發(fā)于ATP耗竭的能量依耐性代謝通路和轉(zhuǎn)運(yùn)功能衰竭、膽管上皮細(xì)胞骨架蛋白受損,有序的聚合

2、、解聚功能破壞以及膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白內(nèi)部化所致。目前,肝移植術(shù)后早期的膽汁成分改變?cè)谀懙罁p傷中的作用越來(lái)越被人所重視。國(guó)內(nèi)有關(guān)移植肝早期的膽汁成分變化的報(bào)道中涉及其因?yàn)榈陌ㄓ?熱缺血、相對(duì)熱缺血、冷保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等,這些都會(huì)導(dǎo)致膽汁中膽鹽/磷脂比例改變,這種改變主要表現(xiàn)為比值增加,增加了膽汁毒性,是移植肝膽道損傷的重要發(fā)病機(jī)制之一。因此,探討肝移植術(shù)后早期膽汁成分變化,并針對(duì)其進(jìn)行干預(yù)處理,對(duì)于指導(dǎo)臨床預(yù)防及治療肝移植術(shù)后膽道損傷,降低肝移植術(shù)

3、后膽道并發(fā)癥發(fā)生率具有十分重要的意義。多烯磷脂酰膽堿化學(xué)結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性磷脂相同但在功能上因其含有必需的多價(jià)不飽和脂肪酸(亞油酸、亞麻酸和油酸)而優(yōu)于后者,可減少自由基攻擊,降低脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。而且,還可分泌入膽汁以穩(wěn)定膽汁。我們推測(cè),如果予以多烯磷脂酰膽堿補(bǔ)充磷脂可能能夠減輕膽汁毒性,從而減輕膽管損傷。
　　 目的
　　 本研究采用大鼠自體原位肝移植模型,應(yīng)用多烯磷脂酰膽堿進(jìn)行處理,以膽汁中總膽汁酸(total bile

4、acid,TBA)濃度、磷脂(phospholipid,PL)濃度、TBA/PL并留取膽道標(biāo)本以檢測(cè)組織病理學(xué)、透射電鏡檢查、膽汁堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)及谷氨?；D(zhuǎn)移酶(glutamyl transferase,γ-GT)水平為觀察參數(shù),探討多烯磷脂酰膽堿對(duì)大鼠肝移植術(shù)中相對(duì)熱缺血(relative warm ischemiatime,RWIT)造成膽道損傷的保護(hù)作用。為臨床合理有效地預(yù)防肝移植術(shù)中

5、RWIT造成膽道損傷提供理論依據(jù)。
　　 方法
　　 1.手術(shù)過(guò)程和動(dòng)物分組
　　 健康、成年、SPF級(jí)純系SD大鼠72只(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),雌雄不限,體重280～300g。大鼠常規(guī)飼養(yǎng),術(shù)前禁食8h,不禁水。按如下步驟進(jìn)行手術(shù)操作:①0.3％戊巴比妥30mg/kg腹腔注射麻醉,麻醉成功后將肝臟完全游離。在十二指腸上方橫斷膽總管,近端插入硬膜外導(dǎo)管并結(jié)扎固定,以備建立膽道外引流通道。②穿刺腹主動(dòng)脈及門(mén)靜

6、脈(portal vein,PV),并使之肝素化。③采用輸液泵行腹主動(dòng)脈及門(mén)靜脈雙重冷灌注,分別灌注4℃含肝素(12.5U/ml)的乳酸林格氏液20ml,速度為2.5ml/min,于肝下下腔靜脈建立灌注液流出道。灌注同時(shí)用4℃乳酸林格氏液澆注肝臟表面降溫。④灌注完成后修補(bǔ)門(mén)靜脈、腹主動(dòng)脈穿刺點(diǎn)以及肝下下腔靜脈流出道,恢復(fù)門(mén)靜脈灌注,結(jié)束無(wú)肝期。根據(jù)各組預(yù)定的膽道相對(duì)熱缺血時(shí)間,分別依次松開(kāi)門(mén)靜脈、肝上下腔靜脈、肝下下腔靜脈、肝動(dòng)脈的血管

7、夾使肝臟復(fù)流,恢復(fù)肝動(dòng)脈的血液灌注。⑤建立膽道外引流通道:用截取自氣管插管氣囊的軟塑料充氣導(dǎo)管將膽總管插管及上段空腸造瘺相連接,建立膽道外引流模型。
　　 將大鼠隨機(jī)分成3組,對(duì)照組(A組),24只,供肝冷灌注結(jié)束后,將門(mén)靜脈(PV)、肝動(dòng)脈(hepatic artery,HA)同時(shí)開(kāi)放恢復(fù)血流灌注。相對(duì)熱缺血組(B組),24只,相對(duì)熱缺血60min組。PV開(kāi)放恢復(fù)血流灌注后60min后再開(kāi)放肝動(dòng)脈HA。干預(yù)組(C組),24只,

8、PV、HA開(kāi)放時(shí)間同B組,并于術(shù)前6h腹腔注射多烯磷脂酰膽堿注射液,并于術(shù)后每日腹腔注射多烯磷脂酰膽堿注射液。檢測(cè)各組術(shù)后2h及術(shù)后第1、3、5天膽汁中總膽汁酸(TBA)濃度、磷脂(PL)濃度、TBA/PL值并留取膽道標(biāo)本以檢測(cè)組織病理學(xué)、透射電鏡檢查、膽汁堿性磷酸酶(ALP)及谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)水平作為檢測(cè)膽管損傷的指標(biāo)。
　　 2.檢測(cè)方法
　　 (1)總膽汁酸鹽(TBA)及磷脂(PL)測(cè)定:TBA測(cè)定采用循

9、環(huán)酶法,試劑盒購(gòu)自寧波賽克生物技術(shù)有限公司；PL檢測(cè)采用酶比色法,試劑盒購(gòu)自北京金豪制藥有限公司。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。(2)堿性磷酸酶(ALP)及谷氨?；D(zhuǎn)移酶(γ-GT)水平測(cè)定:處死大鼠前采集膽汁,用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)膽汁中ALP及γ-GT(南方醫(yī)院檢驗(yàn)中心)。(3)膽道組織病理分析:常規(guī)制作切片,石蠟包埋后,均勻切片至每片4μm,每個(gè)蠟塊組織切3張切片,HE染色后光鏡下觀察。病理結(jié)果量化評(píng)估:按以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)膽管損傷程度進(jìn)行評(píng)分:膽管

10、粘膜上皮細(xì)胞和粘膜下腺體上皮細(xì)胞正常記0分；損傷局限在粘膜上皮層,膽管粘膜上皮細(xì)胞有散在性固縮、壞死、脫落,其數(shù)量不足粘膜上皮細(xì)胞總數(shù)的10％,粘膜下腺體正常記1分； 10％-30％的膽管粘膜上皮細(xì)胞固縮、壞死、脫落,10％以下的粘膜下腺體上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落記2分；超過(guò)30％的膽管粘膜上皮細(xì)胞壞死、脫落,10％-30％的粘膜下腺體上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落記3分。(4)透射電鏡檢查:將標(biāo)本戊二醛液固定2h后,依次經(jīng)過(guò)1％四氧化鋨固定

11、、梯度乙醇脫水、EPON812環(huán)氧樹(shù)脂浸泡包埋并超薄切片、醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色。
　　 3.結(jié)果判定
　　 放大倍數(shù)×8000,Imagepro圖像分析軟件行體視學(xué)形態(tài)定量分析,采用2個(gè)指標(biāo)定量,(1)線粒體腫脹程度,表現(xiàn)線粒體受損情況,以所有線粒體平均體積(MITv)表示；(2)膽管上皮細(xì)胞表面微絨毛覆蓋面積,以膽管上皮細(xì)胞微絨毛的面積密度(Amv)表示。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 計(jì)量資料用(x

12、)±s表示,數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組均數(shù)間比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析,組間兩兩比較采用最小差異t檢驗(yàn)(LSD-t)。相關(guān)性分析若滿足正態(tài)分布則采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn),如不滿足正態(tài)分布則采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 統(tǒng)計(jì)結(jié)果:
　　 (1)膽汁中TBA、PL濃度及TBA/PL值的變化
　　 ①A組術(shù)后TBA、PL及TBA/PL均穩(wěn)定,未出現(xiàn)顯著變化；

13、②TBA濃度:在術(shù)后2h時(shí)間點(diǎn),B、C組顯著低于A組(F=29.91,P<0.01),并逐漸升高,到第3天各組之間TBA濃度已無(wú)顯著差異(F=1.84,P>0.05)。③PL濃度:B組術(shù)后下降顯著,此后緩慢升高,至術(shù)后第5天仍遠(yuǎn)低于A組(P<0.01)。C組術(shù)后2h也出現(xiàn)下降,但高于B組(P<0.01),此后緩慢升高,在第5天與A組已無(wú)顯著差異(P>0.05)。④TBA/PL值:在術(shù)后2h時(shí)間點(diǎn)B組顯著高于A組,并于術(shù)后逐漸升高,至術(shù)后

14、第3天達(dá)到最高,術(shù)后第5天開(kāi)始下降。C組術(shù)后未出現(xiàn)明顯變化,在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)A、C組之間比較無(wú)差異(P>0.05)。
　　 (2)膽汁ALP和γ-GT水平
　　 ①ALP水平:A組最低,C組次之,B組最高,組間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.83,P<0.01)。
　　 ②γ-GT水平:A組最低,C組次之,B組最高,組間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=55.41,P<0.01)。
　　 (3)膽道組織病理評(píng)估

15、>　　 病理形態(tài)學(xué)改變主要為膽管粘膜上皮細(xì)胞有散在性固縮、壞死、脫落及粘膜下腺體上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落,以術(shù)后第3天病理形態(tài)學(xué)改變最為明顯。其中,A組(對(duì)照組)僅偶見(jiàn)膽管上皮細(xì)胞固縮,無(wú)明顯異常； B組(相對(duì)熱缺血組)膽管上皮細(xì)胞大部分固縮,壞死,組織學(xué)改變程度最重；C組(干預(yù)組)出現(xiàn)部分膽管上皮細(xì)胞固縮,壞死,組織學(xué)改變輕于B組；A、B、C組間膽管上皮細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)評(píng)分比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.98.00,P<0.01)。

16、　　 (4)膽管上皮細(xì)胞透射電鏡觀察
　　 膽管上皮細(xì)胞線粒體的形態(tài)改變:正常膽管上皮細(xì)胞微絨毛豐富,排列整齊,線粒體不腫脹,嵴清晰；A組膽管上皮絨毛排列尚整齊,未見(jiàn)明顯脫落,線粒體未見(jiàn)腫脹,嵴清晰,大致正常；B組可見(jiàn)膽管上皮細(xì)胞微絨毛大部分脫落,線粒體空泡變、嵴消失、部分膜破裂；C組可見(jiàn)膽管上皮細(xì)胞微絨毛排列稍紊亂,少部分脫落。線粒體稍腫脹,嵴模糊；膽道上皮細(xì)胞線粒體平均體積(MITv)的定量分析:三組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F

17、=60.95,P<0.01)。膽道上皮細(xì)胞微絨毛的面積密度(Amv)的定量分析:B組最重,C組較輕,A組最輕,三組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=53.63,P<0.01)。
　　 (5)TBA/PL值與膽道損傷的相關(guān)性
　　 經(jīng)過(guò)雙變量相關(guān)分析,得出膽汁中TBA/PL值與ALP水平、γ-GT水平、膽道病理形態(tài)學(xué)評(píng)分、線粒體平均體積均成顯著正相關(guān)(分別r=0.837、0.869、0.835、0.894,P<0.01),與膽道上皮