膽源性iNOS-NO在大鼠自體肝移植膽道相對(duì)熱缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、自1963年Starzl完成第一例人體原位肝移植以來(lái),經(jīng)過(guò)40余年的發(fā)展傘世界已經(jīng)步入了肝移植時(shí)代。雖然肝移植的手術(shù)成功率已超過(guò)90％,但移植術(shù)后的各種并發(fā)癥仍然是阻礙移植肝存活率和受體生存率進(jìn)一步提高的主要因?yàn)椤Ｆ渲心懙啦l(fā)癥是肝移植術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一,其發(fā)生率高達(dá)7％～35％,而且處理困難,嚴(yán)重影響了病人的生存率和生活質(zhì)量。且隨著移植技術(shù)、圍手術(shù)期處理的逐步完善,其他并發(fā)癥的發(fā)生率已明顯下降,而膽道并發(fā)癥的發(fā)生率仍然居高不下。根

2、據(jù)研究發(fā)現(xiàn),膽道重建方式、缺血再灌注損傷、免疫排斥反應(yīng)、感染等因素是導(dǎo)致移植肝膽道形態(tài)結(jié)構(gòu)改變和功能損害的主要因?yàn)?。研究膽道并發(fā)癥的因?yàn)?、發(fā)病機(jī)制和處理措施以降低其發(fā)生率,對(duì)改善患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。
　　 第一部分 大鼠自體肝移植不同相對(duì)熱缺血時(shí)間對(duì)膽道損傷的影響
　　 缺血再灌注損傷是移植肝膽管必須經(jīng)歷的病理生理過(guò)程,這也是導(dǎo)致膽道并發(fā)癥的主要因?yàn)橹?。所造成的損傷程度輕重不同,可導(dǎo)致膽道吻合口或非吻合

3、口狹窄、吻合口膽漏、甚至移植肝原發(fā)性無(wú)功能,而需再次移植。移植肝膽管要經(jīng)歷供肝切除時(shí)的熱缺血損傷、冷保存損傷、植入過(guò)程中的熱缺血損傷、再灌注損傷。目前,大多數(shù)中心采用門(mén)靜脈先灌注(IPR),這樣就使膽管上皮細(xì)胞要比肝細(xì)胞多經(jīng)歷一個(gè)缺血的過(guò)程一門(mén)靜脈開(kāi)放到肝動(dòng)脈開(kāi)放時(shí)間,又稱之為“移植肝膽道相對(duì)熱缺血時(shí)間(RWIT)”或“移植肝膽道二次熱缺血時(shí)間”。這一階段是移植肝膽道熱缺血的一種特殊形式。當(dāng)移植肝放入受體腹腔開(kāi)始移植時(shí),肝細(xì)胞與膽管上皮

4、細(xì)胞即處于溫缺血狀態(tài)。由于肝細(xì)胞接受門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈的雙重血供,在門(mén)靜脈開(kāi)放后肝細(xì)胞恢復(fù)了血流灌注,使肝臟溫度恢復(fù)正常,因?yàn)楦蝿?dòng)脈是膽道系統(tǒng)的唯一血液來(lái)源,從而使膽道由溫缺血環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)闊崛毖獱顟B(tài)。先前的研究表明相對(duì)熱缺血對(duì)膽道的損傷還存在爭(zhēng)論,且以肝細(xì)胞損傷的研究為主。本實(shí)驗(yàn)的目的是在大鼠自體肝移植膽道缺血再灌注損傷模型的基礎(chǔ)上,確定這一時(shí)間是否可以造成膽道損傷,并進(jìn)行不同相對(duì)熱缺血時(shí)間膽道損傷的比較。
　　 材料與方法
　

5、　 健康、成年、SPF級(jí)純系SD大鼠102只,隨機(jī)分成五組,Ⅰ組為假手術(shù)組；Ⅱ組,相對(duì)熱缺血0min組；Ⅲ組,相對(duì)熱缺血30min組；Ⅳ組,相對(duì)熱缺血1h組；Ⅴ組,相對(duì)熱缺血2h組。Ⅱ～V組在肝動(dòng)脈開(kāi)放后1h和2h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)留取標(biāo)本。建立大鼠自體肝移植膽道缺血再灌注損傷模型。TUNEL法檢測(cè)膽管細(xì)胞凋亡并觀察膽道病理形態(tài)學(xué)。研究結(jié)果均以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組均數(shù)間比較采用

6、析因設(shè)計(jì)的方差分析,組間兩兩比較采用最小檢驗(yàn)差異t檢驗(yàn)(LSD-t)。
　　 結(jié)論
　　 相對(duì)熱缺血可以造成膽道損傷,且膽道損傷的程度與相對(duì)熱缺血時(shí)間呈正相關(guān),隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)損傷逐漸加重。為了避免相對(duì)熱缺血對(duì)膽道的損傷,最好將PV與HA同時(shí)再灌注。在目前臨床中如不能同時(shí)再灌注,則將相對(duì)熱缺血時(shí)間盡量縮短,以減少對(duì)膽道的損傷。
　　 第二部分 大鼠移植肝膽道系統(tǒng)不同部位異質(zhì)性對(duì)缺血再灌注損傷耐受性差異的比較

7、r>　　 我們前部分實(shí)驗(yàn)證實(shí)了膽道相對(duì)熱缺血再灌注能夠造成膽道損傷。眾所周知,移植術(shù)后膽道吻合口狹窄及吻合口膽漏發(fā)生率較高。另有大量臨床資料表明,肝門(mén)部膽管發(fā)生狹窄的幾率最高。本實(shí)驗(yàn)的目的是研究膽道系統(tǒng)不同部位膽管上皮細(xì)胞的異質(zhì)性以及膽管周?chē)軈?PVP)構(gòu)筑形式的不同,對(duì)缺血再灌注損傷耐受性的差異。
　　 材料與方法
　　 30只SD大鼠隨機(jī)分成3組,Ⅰ組(假手術(shù)組),Ⅱ組(膽道相對(duì)熱缺血1h再灌注1h組),Ⅲ組(

8、膽道相對(duì)熱缺血1h再灌注2h組)。對(duì)肝門(mén)部膽管、膽總管及小葉間膽管的上皮細(xì)胞行凋亡(TUNEL法)檢測(cè),病理形態(tài)學(xué)評(píng)分和超微結(jié)構(gòu)的定量分析。研究結(jié)果使用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組均數(shù)間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用最小檢驗(yàn)差異t檢驗(yàn)(LSD-t)。
　　 結(jié)論
　　 膽管上皮細(xì)胞的異質(zhì)性及PVP不同部位構(gòu)筑形式的區(qū)別導(dǎo)致了膽道系統(tǒng)各部位損傷程度的差異,肝門(mén)部膽管

9、損傷最重的結(jié)果為ITBL以肝門(mén)部膽管狹窄最為常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 膽總管損傷最輕的結(jié)果提示臨床肝移植中,首先應(yīng)充分重視保護(hù)肝外膽道的血供,供肝修整時(shí)應(yīng)注意保護(hù)膽管周?chē)M織,避免向肝門(mén)方向過(guò)多的游離膽管而破壞膽管血供；其次在行膽管吻合時(shí)應(yīng)避免在肝門(mén)部膽管,盡量以膽總管作為最佳吻合部位。
　　 第三部分 NO(iNoS)/ET-1在膽道相對(duì)熱缺血再灌注損傷中的表達(dá)及相互關(guān)系的研究
　　 我們的前

10、期研究證明了膽道相對(duì)熱缺血可以造成膽道的損傷。缺血再灌注損傷的核心是非特異性炎癥反應(yīng),并有其特殊性。膽管微循環(huán)障礙及膽管上皮細(xì)胞壞死、凋亡是膽道損傷最基本的病理改變,同時(shí)也是肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的根本因?yàn)椤Ｆ渲?膽管微循環(huán)障礙發(fā)揮了重要作用。在多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因了中,一氧化氮合酶(NOS)的催化產(chǎn)物NO是公認(rèn)的擴(kuò)血管物質(zhì),而內(nèi)皮素-1(ET-1)具有強(qiáng)烈的縮血管活性,NO/ET-1途徑在調(diào)節(jié)膽道微循環(huán)血流改變中是否起重要作用,目前還沒(méi)

11、有相關(guān)研究涉及。我們擬從不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)這些因子在膽道的表達(dá)情況,以期初步闡明膽道相對(duì)熱缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制。
　　 材料與方法
　　 42只SD大鼠隨機(jī)分成四組,Ⅰ組(假手術(shù)組),Ⅱ組(相對(duì)熱缺血1h再灌注2h組),Ⅲ組(相對(duì)熱缺血1h再灌注6h組),Ⅳ組(相對(duì)熱缺血1h再灌注12h組)。采用半定量RT-PCR檢測(cè)膽管組織iNos mRNA、ET-1mRNA和VCAM-1mRNA表達(dá)；免疫組化檢測(cè)膽管組織iNOS蛋白

12、表達(dá)；硝酸還原酶比色法測(cè)定NO含量；激光多普勒血流儀測(cè)定膽管組織微循環(huán)血流量。研究結(jié)果使用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組均數(shù)間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析(one-way ANOVA),組間多重比較采用Bonferroni法。
　　 結(jié)論
　　 在Ⅱ組,ET-1mRNA顯著表達(dá)而NO水平顯著下降,NO/ET-1平衡被打破,膽管組織的微循環(huán)血流量顯著下降；在Ⅲ組和Ⅳ組,ET-1mRNA、iNosmRNA及蛋白水平

13、和NO都顯著增加,NO/ET-1平衡繼續(xù)被打破,微循環(huán)血流量降到較低水平,說(shuō)明NO/ET-1途徑可能是造成相對(duì)熱缺血再灌注后膽管PVP微循環(huán)障礙的重要因素之一。
　　 VCAM-1的表達(dá)上調(diào)造成大量的多形核白細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),微血管中亦有大量的炎性細(xì)胞聚積。聚集的白細(xì)胞可以通過(guò)多種機(jī)制加劇膽道缺血后組織損傷。首先,白細(xì)胞可以阻塞微血管,造成“不灌注”或“低灌注”現(xiàn)象的出現(xiàn)；其次,可以促進(jìn)釋放ET-1,超氧陰離子等血管活性物

14、質(zhì),降低血管反應(yīng)性；另外,促進(jìn)細(xì)胞毒性酶類的釋放,產(chǎn)生氧自由基,一氧化氮,磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物,加劇缺血組織損傷。
　　 在膽道相對(duì)熱缺血再灌注損傷中其作用具有爭(zhēng)議的誘生性一氧化氮合成酶-iNOS的表達(dá)加強(qiáng),其真正作用仍不清楚。損傷性抑或保護(hù)性的作用兩者均有可能,有待于以后的深入探討。
　　 第四部分 不同NOS抑制劑對(duì)膽道相對(duì)熱缺血再灌注損傷的影響
　　 膽道在遭受相對(duì)熱缺血再灌注損傷后,在許多促炎癥因子基因被激

15、活的同時(shí)也存在著一些保護(hù)性介質(zhì)的產(chǎn)生。內(nèi)源性NO在肝移植缺血再灌注損傷中的地位和作用目前仍具有較多的爭(zhēng)議,既具有組織細(xì)胞的保護(hù)性作用,又有細(xì)胞的直、間接毒性。從第三部分研究結(jié)果可知:在Ⅲ組(RWIT 1h/R6h)和Ⅳ組(RWIT1h/R12h),iNOS表現(xiàn)為高表達(dá),膽道相對(duì)熱缺血再灌注中iNOS的高表達(dá)究竟具有什么樣的生理功能,是保護(hù)性抑或損傷性角色目前仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)不同NOS抑制劑的應(yīng)用,探討iNOS在膽道相對(duì)熱缺血再灌注

16、損傷中的作用。
　　 材料與方法
　　 42只SD大鼠隨機(jī)分成四組,Ⅰ組(假手術(shù)組),Ⅱ組(相對(duì)熱缺血1h再灌注6h組),Ⅲ組(無(wú)選擇NOS抑制劑L-NA應(yīng)用組),Ⅳ組(高選擇性iNOS抑制劑1400W應(yīng)用組)。采用Western blot法檢測(cè)eNos蛋白及iNos蛋白表達(dá)；激光多普勒血流儀測(cè)定膽管組織微循環(huán)血流量。研究結(jié)果使用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組均數(shù)間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析(one-way

17、ANOVA),組間多重比較采用Bonferroni法。
　　 結(jié)論
　　 NO在器官缺血再灌注損傷中的作用與產(chǎn)生NO的NOS的類型有關(guān),即eNOS來(lái)源的NO產(chǎn)生減少或者iNOS來(lái)源的NO產(chǎn)生過(guò)多均可導(dǎo)致組織損害。
　　 在肝移植膽道相對(duì)熱缺血再灌注損傷中,由iNOS產(chǎn)生的NO能夠加重膽道組織的微循環(huán)障礙。
　　 在臨床實(shí)踐中,高選擇性iNOS抑制劑1400W有待成為一種新型、有效的治療缺血再灌注損傷的臨床