青藤堿保護(hù)大鼠原位肝移植缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝臟缺血再灌注損傷是肝臟移植中常見(jiàn)的問(wèn)題之一,缺血再灌注引起的肝臟損傷是一個(gè)連續(xù)不斷的過(guò)程,并最終導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。這個(gè)過(guò)程是在肝臟短暫缺氧并再氧合時(shí)觸發(fā),臨床上許多情況下可發(fā)生肝臟缺血再灌注,例如肝臟低灌流狀態(tài),各種各樣的外科手術(shù)操作,以及移植中的供體器官切取。實(shí)際上肝臟缺血再灌注損傷是抗原成分獲取的結(jié)果,是影響肝臟移植結(jié)果的重要因素,引起10％左右的早期移植后器官功能衰竭,并且急性和慢性排異的發(fā)生率較高。此外,由于邊緣性供體對(duì)于缺血再

2、灌注損傷非常敏感,這加劇了供體器官的短缺。因此減少缺血再灌注損傷能明顯增加獲得手術(shù)成功的病人數(shù)量。然而,到目前為止仍沒(méi)有可以預(yù)防缺血再灌注損傷的有效方法。所以,為了保護(hù)細(xì)胞和器官的功能,需要通過(guò)廣泛的研究更好的了解肝臟缺血再灌注損傷的機(jī)制以及尋找合適的干預(yù)方法必要的。 青藤堿是從防己科防己屬植物青風(fēng)藤Sinomenium acutum Rehd.et Wils.根莖中分離出的主要活性成分,其結(jié)構(gòu)類似于嗎啡,分子式為C19H23N

3、O4,分子量為329.38,具有鎮(zhèn)痛,抗炎等作用,臨床主要用于類風(fēng)濕病的治療,療效確切。國(guó)內(nèi)外的研究表明,青藤堿具有良好的抗炎、免疫抑制作用。但是在缺血再灌注損傷中的作用卻未見(jiàn)報(bào)道。本課題應(yīng)用“二袖套”法建立大鼠原位肝移植模型,研究青藤堿在肝臟缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。 第一部分：青藤堿對(duì)大鼠原位肝移植缺血再灌注損傷的保護(hù)作用 目的：探討青藤堿對(duì)大鼠原位肝移植缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

4、方法：應(yīng)用SD大鼠為模型動(dòng)物；采用Kamada's“二袖套法”建立SD→SD大鼠原位肝移植模型,大鼠196只隨機(jī)分為假手術(shù)組、生理鹽水對(duì)照組、低劑量(40mg/kg)和高劑量青藤堿治療組(80mg/kg),將供肝在4℃林格液中保存5h后植入受體,分別觀察移植術(shù)后1周存活率,檢測(cè)移植術(shù)后2,6,12,24h血清ALT、AST,TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI),RT-PCR檢測(cè)肝臟組織中的TNF-a、IL-1B、ICAM-1mRNA的

5、含量,ELISA檢測(cè)血清IL-2含量,并觀察移植肝臟病理形態(tài)學(xué)的改變。 結(jié)果： 與對(duì)照組比較,青藤堿低劑量、高劑量治療組術(shù)后1周存活率顯著提高(75％,75％vs 12.5％,P<0.01),在各個(gè)時(shí)間點(diǎn),青藤堿治療組的ALT、AST水平明顯低于生理鹽水對(duì)照組(P<0.01),肝組織中的TNF-a、IL-1B、ICAM-1mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比均顯著減少(P<0.01),肝細(xì)胞凋亡指數(shù)下降,在肝移植術(shù)后24小時(shí),生理鹽

6、水對(duì)照組的AI為37.0±4.30,而在青藤堿兩治療組分別為23.8±3.27、18.6±3.03,與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.01)。血清IL-2含量降低,肝細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)也明顯改善。 結(jié)論：青藤堿可以通過(guò)抑制Kupffer細(xì)胞激活及釋放TNF-a、IL-1B等炎癥性細(xì)胞因子及ICAM-1等粘附分子,抑制肝細(xì)胞凋亡,減少細(xì)胞免疫相關(guān)IL-2的分泌,減輕肝細(xì)胞及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,達(dá)到保護(hù)肝移植缺血再灌注損傷的效果。

7、 第二部分：青藤堿對(duì)大鼠肝移植缺血再灌注后TLR4、MAPKs和NF-kB表達(dá)的影響 目的：通過(guò)觀察不同劑量的青藤堿對(duì)大鼠肝移植術(shù)后TLR4、MAPKs和NF-κB的影響,探討青藤堿保護(hù)大鼠肝移植缺血再灌注損傷的機(jī)制。 方法：應(yīng)用“二袖套法”建立SD→SD大鼠原位肝移植模型,大鼠196只隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組、低劑量(40mg/kg)和高劑量青藤堿治療組(80mg/kg),將供肝在4℃林格液中保存5h后植入受體

8、,選擇缺血再灌注后大鼠肝功能損傷最嚴(yán)重的術(shù)后6小時(shí)為觀察點(diǎn)。采用Western Blot方法檢測(cè)大鼠肝臟組織的TLR4、磷酸化JNK、ERK、p38 MAPK和NF-κB蛋白表達(dá)的變化情況。 結(jié)果：在假手術(shù)組TLR4呈低表達(dá),生理鹽水對(duì)照組TLR4呈高表達(dá),青藤堿顯著降低了肝組織TLR4的表達(dá)(P<0.01)。磷酸化JNK、ERK在各組的表達(dá)比較無(wú)明顯差異。磷酸化p38 MAPK和NF-κB在假手術(shù)組呈低表達(dá),在生理鹽水對(duì)照組高

9、表達(dá),而青藤堿明顯抑制了磷酸化p38 MAPK和NF-κB的表達(dá)(P<0.01)。 結(jié)論：青藤堿保護(hù)大鼠肝移植缺血再灌注損傷的機(jī)制與抑制TLR4介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)有關(guān),通過(guò)抑制p38MAPK信號(hào)通路和NF-κB通路,減少下游TNF-a、IL-1B和ICAM-1等炎癥細(xì)胞因子的分泌。 第三部分：青藤堿對(duì)肝臟缺血再灌注后抗原提呈細(xì)胞的影響 目的：通過(guò)觀察不同劑量的青藤堿對(duì)大鼠肝移植缺血再灌注后肝臟來(lái)源的DC成熟和功能

10、的影響,深入了解青藤堿保護(hù)缺血再灌注損傷作用的機(jī)制。 方法：應(yīng)用“二袖套法”建立SD→SD大鼠原位肝移植模型,大鼠48只隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、低劑量(40mg/kg)和高劑量青藤堿治療組(80mg/kg),將供肝在4℃林格液中保存2h后植入受體,術(shù)后第三天切取肝臟,分離純化肝臟DC,觀察青藤堿對(duì)其成熟和功能的影響。以熒光抗體標(biāo)記和流式細(xì)胞儀對(duì)DC進(jìn)行表型分析OX62和MEtC-Ⅱ、CD86等分子。EACS檢測(cè)移植后肝臟DC對(duì)熒

11、光標(biāo)記的卵清蛋白(OVA-FITC)能力,分析青藤堿對(duì)肝臟DC內(nèi)吞功能的影響。收集獲取的DC,用RT-PCR方法測(cè)定其中具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子IL-12,IL-1,TNF-a mRNA的表達(dá)水平,Western Blot方法檢測(cè)各組肝臟DC表達(dá)的TLR4。收集各處理組肝臟DC以3H-TdR摻入法進(jìn)行DC刺激同種異基因T細(xì)胞增殖功能(MLR)的檢測(cè)。 結(jié)果：FACS分析顯示,青藤堿處理組DC呈現(xiàn)不成熟DC的表型,DC表面MHC

12、-Ⅱ類分子和CD86等分子表達(dá)均顯著下降,而對(duì)照組則表現(xiàn)為成熟DC表型,高表達(dá)MHC-Ⅱ類分子和CD86分子。內(nèi)吞功能試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)青藤堿處理組平均熒光強(qiáng)度較對(duì)照組的明顯增強(qiáng),表明了青藤堿對(duì)肝臟DC向成熟DC轉(zhuǎn)化具有抑制作用。提示青藤堿可顯著降低缺血再灌注后肝臟DC的抗原提呈功能。對(duì)照組肝臟DC表達(dá)IL-12,IL-1,TNF-a mRNA等水平明顯增高,TLR4蛋白的表達(dá)明顯升高,而青藤堿處理組可不同程度抑制這種效應(yīng)(P<0.01)。DC刺