日本結(jié)縷草植株再生體系優(yōu)化及根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的初步研究.pdf

1、日本結(jié)縷草(ZoysiajaponicaSteud.)是一種優(yōu)良的草坪草，它具有耐踐踏、抗高溫干旱、抗寒、耐瘠薄、抗鹽堿和低維護(hù)等特性，同時(shí)其獨(dú)特的地下根莖具有強(qiáng)大的固土護(hù)坡和防治水土流失的功能。但作為草坪草，結(jié)縷草存在著抗蟲、抗病性差等弱點(diǎn)，尤其綠期短在一定程度上制約了該草種的應(yīng)用。傳統(tǒng)的有性雜交育種能在一定程度上改良該草種，但其種子不易萌發(fā)、雌花早熟等問(wèn)題增加了獲得雜種后代的難度。因此，有必要借助現(xiàn)代生物技術(shù)育種手段加速該草種的遺傳

2、改良進(jìn)程。在前人的研究基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步優(yōu)化了日本結(jié)縷草的植株再生體系，成功地保存了一個(gè)具有分化能力的愈傷系，截止2005年4月己達(dá)17個(gè)月，該愈傷系在繼代培養(yǎng)過(guò)程中能保持較高的分化能力；通過(guò)對(duì)長(zhǎng)期繼代的愈傷組織進(jìn)行組織學(xué)切片觀察，分析了愈傷組織分化成苗的發(fā)生途徑；在此基礎(chǔ)上利用gus報(bào)告基因?qū)τ绊懜┺r(nóng)桿菌介導(dǎo)日本結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化的條件進(jìn)行了初步研究，建立了日本結(jié)縷草愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系，為結(jié)縷草基因工程改良奠定了一定的基礎(chǔ)。主要研究

3、結(jié)果如下： 1.日本結(jié)縷草植株再生體系的優(yōu)化。以日本結(jié)縷草種子為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素2，4-D最佳有效濃度范圍為2.0-3.0mg/L，加入低濃度細(xì)胞分裂素BA(0.01-0.02mg/L)有利于誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)一步的長(zhǎng)期繼代和分化。結(jié)果表明，愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為：基本培養(yǎng)基Ⅰ+2,4-D2.0-3.0mg/L+BA(0.01-0.02mg/L)。 繼代培養(yǎng)基中適當(dāng)降低2,4-D濃度和添加

4、一定量的KT(0.5mg/L)有利于愈傷組織的保存和分化狀態(tài)愈傷組織的成熟。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，愈傷組織繼代的最佳培養(yǎng)基為：基本培養(yǎng)基Ⅱ+2，4-D2.0mg/L+KT0.5mg/L。 愈傷組織成苗的最佳培養(yǎng)基為：MS+NAA0.3mg/L+KT0.5mg/L+BA1.0m/gL。 2.在愈傷組織成苗過(guò)程中，大多數(shù)經(jīng)過(guò)器官發(fā)生途徑，同時(shí)也存在著體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑，通過(guò)組織切片觀察到了體細(xì)胞胚的多個(gè)時(shí)期。 3.初步建立了

5、以愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。以本研究誘導(dǎo)出的愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行g(shù)us報(bào)告基因的遺傳轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)化過(guò)程中對(duì)根癌農(nóng)桿菌菌液濃度、細(xì)菌懸浮培養(yǎng)液、侵染時(shí)間、以及共培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)方式等轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了摸索。實(shí)驗(yàn)表明：日本結(jié)縷草的愈傷組織選擇壓力(潮霉素)為45-60mg/L；轉(zhuǎn)化過(guò)程中將活力旺盛的愈傷組織在根癌農(nóng)桿菌菌液(OD600值為0.20-0.60)侵染18小時(shí)以上，在含100μmol/L的乙酰丁香酮的培養(yǎng)基上共