脂質(zhì)體介導(dǎo)99Tcm-EGFRmRNA反應(yīng)肽核酸腫瘤顯像的實驗研究.pdf

1、目的:研究脂質(zhì)體介導(dǎo)放射性核素99Tcm標(biāo)記的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）mRNA反義肽核酸(peptidenucleic acid，PNA)的方法，測定該反義分子探針的標(biāo)記率，評價其體內(nèi)外穩(wěn)定性，并探討脂質(zhì)體介導(dǎo)對99Tcm標(biāo)記EGFR mRNA反義PNA體外靶細(xì)胞攝取、荷瘤裸鼠體內(nèi)生物學(xué)分布及特異性顯像的影響。探索促進(jìn)99Tcm標(biāo)記EGFR mRNA反義肽核酸分子探

2、針進(jìn)入靶細(xì)胞的方法，進(jìn)一步提高該核素分子探針腫瘤基因顯像的效果。
　　方法:以EGFR mRNA（genbank序列號:NM_201283.1）的第503-519堿基序列(17bp)為靶序列，設(shè)計反義PNA5'-AATGAGGACATAACCAG-3'，于其5'端連接由Gly-(D)-Ala-Gly-Gly4個氨基酸形成并且能與99Tcm進(jìn)行強(qiáng)力螯合的類似N4結(jié)構(gòu)的短肽，最后在PNA與該結(jié)構(gòu)之間引入可以消除空間阻礙的隔離物γ-氨基

3、丁酸(4-aminobutyric acid，Aba)，完成反義PNA分子的合成。因PNA不帶電荷，為了使反義PNA分子帶負(fù)電荷以利于脂質(zhì)體包裹，再合成與上述反義PNA3'末端8個堿基互補(bǔ)的短寡核苷酸鏈，即5'-CTGGTTAT-3'結(jié)構(gòu)。利用堿基互補(bǔ)配對原則將帶有短肽螯合功能的EGFR mRNA反義PNA與部分互補(bǔ)寡核苷酸雜交，使反義PNA分子帶負(fù)電荷后進(jìn)行99Tcm標(biāo)記，標(biāo)記后以脂質(zhì)體包裹反義探針。用反相高效液相色譜法(revers

4、e-phase highperformance liquid chromatography, RP-HPLC)鑒定脂質(zhì)體介導(dǎo)及非介導(dǎo)的99Tcm標(biāo)記EGFR mRNA反義PNA(99Tcm-EGFR-PNA)的標(biāo)記率。并將兩者于37℃條件下分別在生理鹽水及人新鮮血清中孵育1、2、4、6、12、24h，用RT-HPLC測定各自在不同介質(zhì)及不同時間點的放射化學(xué)純度，以檢測其體外穩(wěn)定性。并采用靜置貼壁法培養(yǎng)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞及人乳腺癌MD

5、A-MB-435S細(xì)胞，收集對數(shù)生長期細(xì)胞，按每只裸鼠1×1011/L的濃度接種0.2ml到無特異病原體級裸鼠右前肢外側(cè)皮下，當(dāng)瘤體直徑約1cm時，選取腫瘤形態(tài)規(guī)則、色澤紅潤、大小無明顯差異的荷瘤裸鼠用于實驗。用RP-HPLC測定EGFR高表達(dá)的SKOV3細(xì)胞荷瘤裸鼠注射脂質(zhì)體介導(dǎo)及非介導(dǎo)分子探針后2-3h時的尿液中分子探針的放化純，以監(jiān)測分子探針體內(nèi)穩(wěn)定性。研究脂質(zhì)體介導(dǎo)與非介導(dǎo)的分子探針在EGFR高表達(dá)的SKOV3細(xì)胞及EGFR低表

6、達(dá)的MDA-MB-435S細(xì)胞的攝取以及滯留情況，以了解探針的藥代動力學(xué)。取32只SKOV3細(xì)胞荷瘤裸鼠，利用隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，每組16只。各組分別注射脂質(zhì)體介導(dǎo)及非介導(dǎo)99Tcm-EGFR-PNA。取16只MDA-MB-435S細(xì)胞荷瘤裸鼠，尾靜脈注射脂質(zhì)體介導(dǎo)99Tcm-EGFR-PNA。在各組內(nèi)按隨機(jī)數(shù)字表法分別于注藥后1、2、4、6h各取4只動物模型，眼靜脈取血后，頸椎脫臼處死，取各臟器分別測定其放射性計數(shù)并稱重，測定3個標(biāo)

7、準(zhǔn)源的放射性計數(shù)，計算每克組織中放射性計數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)源（3個標(biāo)準(zhǔn)源均值）的比值即％ID/g以及腫瘤與肌肉組織的％ID/g比值(tumor to muscle，T/M)。比較各時間點脂質(zhì)體介導(dǎo)對分子探針在動物模型體內(nèi)分布的影響。取10只SKOV3細(xì)胞荷瘤裸鼠，利用隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，每組5只。各組分別注射脂質(zhì)體介導(dǎo)及非介導(dǎo)的99Tcm-EGFR-PNA。取5只MDA-MB-435S細(xì)胞荷瘤裸鼠，尾靜脈注射脂質(zhì)體介導(dǎo)99Tcm-EGFR-PN

8、A。均于注藥后1、2、4、6、8、10h行靜態(tài)顯像，觀察各組內(nèi)隨時間變化腫瘤部位放射性濃聚的變化，利用感興趣區(qū)技術(shù)測定腫瘤部位放射性計數(shù)與對側(cè)正常部位同等區(qū)域放射性計數(shù)的比值（target to nontarget ratio，T/NT），并比較3組間顯像的差異。所有實驗數(shù)據(jù)均采用SAS9.1統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對數(shù)據(jù)進(jìn)行兩樣本t檢驗（或t'檢驗）或Wilcoxon秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)

9、意義。
　　結(jié)果:經(jīng)RP-HPLC法檢測，脂質(zhì)體介導(dǎo)及非介導(dǎo)的99Tcm-EGFR-PNA放射及紫外峰幾乎均為單峰，放射峰保留時間分別為19min、12.5min，6h內(nèi)標(biāo)記率分別為（95.17±0.55）％(n=6)、（98.75±1.09）％(n=6)，均較高，滿足體內(nèi)顯像要求，無需進(jìn)一步純化。于37℃水浴條件下，在生理鹽水及人新鮮血清中各孵育1、2、4、6、12和24 h，6h內(nèi)分子探針放射化學(xué)純度均在90％以上，且放射峰位

10、置較穩(wěn)定，未見漂移。RP-HPLC鑒定注射了脂質(zhì)體介導(dǎo)或非介導(dǎo)分子探針的荷瘤裸鼠的尿液，其放射峰出現(xiàn)時間點均以標(biāo)記物走樣時的保留時間點為主，主峰前出現(xiàn)一小代謝物峰，但并非游離99TcmO4-。尿液中脂質(zhì)體介導(dǎo)及非介導(dǎo)的分子探針的放化純分別為89.3％和90.0％。
　　脂質(zhì)體介導(dǎo)明顯提高了EGFR高表達(dá)的SKOV3細(xì)胞對分子探針的攝取率（t'=47.11-58.67，Z=2.80，均P＜0.05），最高可達(dá)8.8倍。加入脂質(zhì)體后細(xì)

11、胞對反義探針的攝取高峰時間由不加脂質(zhì)體時的6h延遲至12h。EGFR高表達(dá)的SKOV3細(xì)胞對脂質(zhì)體介導(dǎo)99Tcm-EGFR-PNA的細(xì)胞攝取率明顯高于MDA-MB-435S細(xì)胞對其攝取率(t=20.54-30.16，t'=9.45，Z=2.80，均P＜0.05)。脂質(zhì)體介導(dǎo)后人卵巢癌SKOV3細(xì)胞對反義探針滯留率增加(t'=7.25-11.55，Z=2.80，均P＜0.05)。體內(nèi)生物分布實驗顯示，在EGFR高表達(dá)SKOV3細(xì)胞荷瘤模型

12、組，探針主要分布在腫瘤、肝臟、腎臟，腫瘤組織放射性計數(shù)明顯高于瘤體對側(cè)肌肉組織的放射性計數(shù)，并且隨時間延長，逐漸增加。脂質(zhì)體介導(dǎo)可以明顯提高不同時刻T/M值（t=11.24，t'=3.96-11.94，均P＜0.05）。并且注射脂質(zhì)體介導(dǎo)99Tcm-EGFR-PNA后SKOV3細(xì)胞荷瘤裸鼠各時間點的T/M值明顯高于MDA-MB-435S細(xì)胞荷瘤裸鼠的T/M值(t=9.69，11.84，t'=6.2，6.23，均P＜0.05)。
　

13、　體內(nèi)顯像實驗顯示，SKOV3細(xì)胞荷瘤裸鼠注射脂質(zhì)體介導(dǎo)99Tcm-EGFR-PNA1h后腫瘤組織即有明顯放射性核素濃聚，隨時間延長濃聚程度增加，6h達(dá)攝取高峰，之后放射性核素濃聚程度輕度減低。SKOV3細(xì)胞荷瘤裸鼠非脂質(zhì)體介導(dǎo)組，注藥后1h腫瘤部位出現(xiàn)輕度攝取，6h達(dá)攝取高峰，之后放射性核素濃聚程度快速減低。并且脂質(zhì)體介導(dǎo)可以明顯增加各時間點T/NT值（t=3.96，t'=12.65-14.69，Z=2.83-5.29，均P＜0.05