99Tcm標(biāo)記HER2親和體腫瘤顯像的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本研究將人表皮生長(zhǎng)因子受體2（Human epidermal growth factor receptor2, HER2）親和體 ZHER2:2891的 C末端用四個(gè)氨基酸-G(Gly)GGC(Cys)作為螯合劑進(jìn)行修飾，并對(duì)其進(jìn)行放射性核素99Tcm標(biāo)記，制備HER2親和體分子影像探針99Tcm-ZHER2:2891，測(cè)定該分子探針的標(biāo)記率，評(píng)價(jià)其體內(nèi)外穩(wěn)定性，應(yīng)用HER2高表達(dá)的SKOV3細(xì)胞及荷瘤裸鼠模型進(jìn)行細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)、體

2、內(nèi)分布和顯像研究，并與HER2低表達(dá)的MCF-7細(xì)胞裸鼠進(jìn)行顯像對(duì)比，探討分子影像探針99Tcm-ZHER2:2891對(duì)HER2高表達(dá)腫瘤診斷可行性。
　　方法：應(yīng)用Fmoc/tBu多肽固相合成法合成ZHER2:2891，并在其C末端連接4個(gè)氨基酸(-GGGC)，形成1個(gè)能與99Tcm進(jìn)行強(qiáng)力螯合的類似N3S結(jié)構(gòu)的短肽，利用配體交換法進(jìn)行99Tcm標(biāo)記。用反相高效液相色譜法(reverse-phase high performan

3、ce liquid chromatography, RP-HPLC)及紙層析法測(cè)定99Tcm標(biāo)記的ZHER2:2891（99Tcm-ZHER2:2891）的標(biāo)記率。并將該分子探針于37℃條件下分別在生理鹽水及人新鮮血清中孵育1、2、4、6、8h，用RT-HPLC測(cè)定其在不同介質(zhì)及不同時(shí)間點(diǎn)中的放化純，以檢測(cè)其體外穩(wěn)定性。采用靜置貼壁法培養(yǎng)HER2高表達(dá)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞及HER2低表達(dá)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，制備荷瘤裸鼠模型。收集處

4、于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，用不含胎牛血清的培基配成單細(xì)胞懸液，使每0.2ml懸液中含細(xì)胞個(gè)數(shù)為1×107個(gè)，于SPF（specific pathogen free，無(wú)特定病原體）級(jí)BALB/c裸鼠右前肢外側(cè)皮下接種0.2ml單細(xì)胞懸液，待腫瘤直徑約1.5-2.0cm時(shí)，選取腫瘤大小無(wú)明顯差異的荷瘤裸鼠用于實(shí)驗(yàn)。同樣方法于裸鼠左前肢外側(cè)皮下制備HER2低表達(dá)人乳腺癌MCF-7荷瘤裸鼠模型。將分子探針99Tcm-ZHER2:2891注射

5、入荷瘤裸鼠體內(nèi)并收集注射分子探針后1.5-2h時(shí)的尿液，用RT-HPLC測(cè)定尿液中的放射性化學(xué)純度，以測(cè)定99Tcm-ZHER2:2891的體內(nèi)穩(wěn)定性。研究該分子探針在 HER2高表達(dá) SKOV3細(xì)胞的細(xì)胞攝取、滯留、內(nèi)化及阻斷情況，以了解該探針在體外的藥代動(dòng)力學(xué)及特異性。隨機(jī)取16只SKOV3細(xì)胞荷瘤裸鼠模型，利用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組4只，各組分別經(jīng)尾靜脈注射99Tcm-ZHER2:2891，于注藥后1、2、4、6h隨機(jī)取一

6、組動(dòng)物模型，眼靜脈取血后，頸椎脫臼處死，即刻取出心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、小腸、肌肉、骨骼、腦、腫瘤分別測(cè)定其放射性計(jì)數(shù)并稱重，并同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)源的放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織中放射性計(jì)數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)源的比值即％ID/g以及腫瘤與肌肉組織的%ID/g比值(tumor to muscle, T/M)。研究各時(shí)間點(diǎn)該分子探針在HER2高表達(dá)動(dòng)物模型的體內(nèi)分布。隨機(jī)取5只SKOV3荷瘤裸鼠，經(jīng)尾靜脈注射99Tcm-ZHER2:2891，于注藥后1

7、、2、4、6、8h行靜態(tài)顯像，并行MCF-7荷瘤裸鼠顯像進(jìn)行對(duì)比，觀察各組內(nèi)隨時(shí)間變化腫瘤部位放射性濃聚的變化情況，利用感興趣區(qū)技術(shù)測(cè)定腫瘤部位放射性計(jì)數(shù)與對(duì)側(cè)同等區(qū)域正常部位放射性計(jì)數(shù)的比值(target to nontarget ratio, T/NT)，并比較2組間顯像的差異。另隨機(jī)取5只SKOV3裸鼠模型，在注射99Tcm-ZHER2:2891之前5分鐘，注射過量未標(biāo)記的 ZHER2:2891進(jìn)行阻斷特異性研究，于注藥后1、2、

8、4、6、8h行靜態(tài)顯像，觀察各組內(nèi)隨時(shí)間變化腫瘤部位放射性濃聚的變化，計(jì)算T/NT比值，并與非阻斷組進(jìn)行比較。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，采用SPSS13.0及GraphPad Prism5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及統(tǒng)計(jì)圖制作，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩樣本 t檢驗(yàn)(或t'檢驗(yàn))或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：經(jīng)RP-HPLC檢測(cè)，99Tcm-ZHER2:2891放射峰保留時(shí)

9、間為11.66min,標(biāo)記20min后標(biāo)記率為（99.29±0.43）%（n=6），標(biāo)記率較高，滿足體內(nèi)顯像要求，無(wú)需進(jìn)一步純化。于37℃水浴條件下，在生理鹽水及人新鮮血清中各孵育1、2、4、6和8 h，8h內(nèi)分子探針放化純均在96%以上，且放射峰位置較穩(wěn)定，未見漂移。RP-HPLC測(cè)定注射99Tcm-ZHER2:2891后荷瘤裸鼠的尿液，保留時(shí)間呈雙峰，主峰與99Tcm-ZHER2:2891放射峰保留時(shí)間一致，主峰前一小的放射峰，該峰

10、與99TcmO4-保留時(shí)間不一致，為一代謝物峰，但并非游離99TcmO4-。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，人卵巢癌SKOV3細(xì)胞對(duì)99Tcm-ZHER2:2891的體外攝取率在1、2、4、6、8、12、24h分別為（5.27±0.32）%、（5.38±0.74）%、（5.74±1.03）%、（4.50±1.45）%、（5.68±0.95）%、（12.41±1.28）%、（10.79±2.46）%，表明攝取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，在6h時(shí)攝

11、取率稍有下降，但整體是上升趨勢(shì)，至12h達(dá)到最大值，之后略降低，但變化不大。人卵巢癌SKOV3細(xì)胞對(duì)99Tcm-ZHER2:2891的細(xì)胞滯留實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分子探針在細(xì)胞內(nèi)滯留率相對(duì)較高可達(dá)51.30%。細(xì)胞內(nèi)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，隨著時(shí)間延長(zhǎng)內(nèi)化率整體呈曲線上升趨勢(shì)，表明99Tcm-ZHER2:2891與細(xì)胞膜上的HER2受體結(jié)合可轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)。阻斷組SKOV3細(xì)胞在加入99Tcm-ZHER2:2891同時(shí)分別加入500倍及1000倍過量的未標(biāo)記的Z

12、HER2:2891，4h時(shí)的細(xì)胞攝取率從（5.74±1.03）%分別降到了（0.45±0.05）%、（0.38±0.04）%，有顯著性差異(t=-8.88，P=0.001；t=-9.01，P=0.001)，表明99Tcm-ZHER2:2891與HER2體外結(jié)合可被未標(biāo)記的ZHER2:2891阻斷，探針具有靶向特異性。
　　荷瘤裸鼠體內(nèi)分布結(jié)果，99Tcm-ZHER2:2891在HER2高表達(dá)SKOV3荷瘤裸鼠腫瘤組織內(nèi)分布較高，在

13、1、2、4、6h分別為（4.14±1.61）（、6.47±2.09）、（5.04±2.58）、（10.07±0.33）%ID/g，其T/M比值由1h的4.87±0.47增長(zhǎng)至6h的29.94±18.35。此外，除腎臟外，99Tcm-ZHER2:2891在大部分正常組織或器官中被快速清除。體內(nèi)顯像實(shí)驗(yàn)顯示，SKOV3荷瘤裸鼠注射99Tcm-ZHER2:28911h后腫瘤組織即有明顯放射性核素濃聚，隨時(shí)間延長(zhǎng)濃聚程度增加，6h達(dá)攝取高峰，6

14、h與8h攝取沒有顯著差異。MCF-7細(xì)胞荷瘤裸鼠顯像，注藥后1h腫瘤部位無(wú)明顯放射性核素濃聚，之后可見輕度放射性核素濃聚，但未見明顯攝取高峰。兩組各時(shí)間點(diǎn)T/NT比值相比， SKOV3荷瘤裸鼠模型組明顯高于MCF-7荷瘤裸鼠模型組。注射未標(biāo)記的ZHER2:2891可阻斷顯像效果，T/NT比值均較非阻斷組下降。
　　結(jié)論：99Tcm標(biāo)記的HER2親和體ZHER2:2891標(biāo)記方法簡(jiǎn)便，標(biāo)記率高，無(wú)需純化，可直接應(yīng)用于動(dòng)物體內(nèi)顯像實(shí)驗(yàn)