慢病毒載體介導(dǎo)的人乳腺癌SKBR-3細胞HER2基因沉默的實驗及顯像研究.pdf

1、目的:研究特異性HER2-shRNA慢病毒載體體外感染乳腺癌細胞SKBR-3后人表皮生長因子受體2(HER2)基因的沉默對腫瘤細胞生物學(xué)行為的影響,并通過體內(nèi)移植瘤實驗研究靶向沉默HER2基因后對腫瘤的基因治療作用以及SPECT顯像活體評價RNA干擾(RNA interference,RNAi)效能的可行性,初步探索SPECT分子影像技術(shù)在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用前景。
　　方法:①利用本實驗室保存的有效HER2-短發(fā)夾狀(sh)RNA

2、(HER2-short hairpin RNA,HER2-shRNA)慢病毒表達載體和一條隨機序列陰性對照慢病毒載體感染乳腺癌SKBR-3細胞株,通過嘌呤霉素篩選建立穩(wěn)定表達HER2-小干擾(si)RNA(HER2-small interfering RNA,HER2-siRNA)的SKBR-3細胞株及陰性對照細胞株,組成KD組和NC組,并將未感染的SKBR-3細胞作為CON組。②通過Real time PCR、流式細胞儀及Wester

3、n blot檢測各組細胞HER2 mRNA及蛋白的表達,流式細胞儀、MTT法、Transwell細胞侵襲實驗及劃痕實驗分別檢測各組細胞的凋亡、增殖、侵襲及遷移能力。③將各實驗組細胞接種于裸鼠,建立荷人乳腺癌裸鼠模型實驗(KD)組和陰性對照(NC)組,并以未感染的SKBR-3細胞株裸鼠模型作為空白對照(CON)組,觀察各組移植瘤的生長狀況,監(jiān)測瘤體大小,免疫組織化學(xué)法測定各實驗組離體移植瘤HER2蛋白的表達情況。④通過131I-曲妥珠單克

4、隆抗體(Herceptin)對乳腺癌裸鼠進行SPECT放射免疫顯像,追蹤觀察腫瘤顯影情況,比較各實驗組T/B(腫瘤/本底)比值。
　　結(jié)果:①經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達有效干擾序列和陰性對照序列的實驗細胞株,經(jīng)流式細胞儀檢測,NC組和KD組的熒光表達率均大于80％。②Real time PCR檢測結(jié)果顯示CON、NC、KD組細胞HER2 mRNA的相對含量(HER2/β-actin)分別為1.000、1.081、0.326,KD組

5、與CON和NC組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),KD組的HER2 mRNA抑制率為67.4％;此外,應(yīng)用流式細胞儀測得CON組、NC組和KD組HER2蛋白的表達率分別為(92.40±2.01)％、(92.97±2.44)％、和(55.13±1.65)％,KD組明顯低于NC和CON組,差異有顯著性(P<0.01),其HER2蛋白的抑制率為(40.58±0.96)％;Western blot結(jié)果顯示CON組和NC組HER2蛋白的相對

6、表達量分別為(0.5481±0.0102)和(0.5494±0.0135),而KD組明顯下降,僅為(0.2784±0.0099),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);MTT檢測結(jié)果顯示與CON組和NC組相比,KD組細胞增殖明顯減慢(P<0.01);KD組細胞早期凋亡為(12.8±0.82)％,顯著高于CON組(2.67±0.15)％及NC組(3.27±0.35)％(P<0.01);Transwell及細胞劃痕實驗顯示KD組較其他兩組的侵襲

7、和遷移能力顯著下降。③體內(nèi)動物實驗結(jié)果顯示與CON組和NC組相比,KD組乳腺癌移植瘤平均瘤體體積、瘤體重量明顯減小(P<0.05);免疫組化結(jié)果亦顯示KD組HER2蛋白的表達明顯下調(diào);裸鼠經(jīng)尾靜脈注射131I-Herceptin后多次追蹤顯像,移植瘤部位的放射性隨時間的延長逐漸濃聚,各時間點T/B值經(jīng)組織厚度校正后, KD組均小于CON和NC組。除1h的首次顯像外,其余各時間點差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:特異性H