miRNA-125b-1對乳腺癌SKBR-3細胞放化療敏感性的影響.pdf

1、研究背景:
　　 乳腺癌(breastcancer)是指發(fā)生于乳腺導(dǎo)管上皮細胞的惡性腫瘤，是女性常見的腫瘤之一，約占全身惡性腫瘤的7％-10％。全世界每年新發(fā)乳腺癌約150萬例，死亡約57萬例。北美、歐洲等西方發(fā)達國家為高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率為亞、非、拉地區(qū)的4倍左右。我國雖屬乳腺癌低發(fā)區(qū)的國家，但近20年來發(fā)病率有增高趨勢，特別是在北京、上海、廣州等經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)，乳腺癌已成為威脅女性健康的重要危害，有可能超過宮頸癌而居女性惡性腫瘤的

2、首位。乳腺癌的發(fā)生是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，發(fā)生機制涉及多基因的突變，包括癌基因激活、抑癌基因失活以及其它相關(guān)調(diào)節(jié)基因的突變，從而使細胞基因組失去穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。又由于女性乳房淋巴管網(wǎng)，回流靜脈之間吻合豐富，乳腺癌早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移至肺、骨肝、腦等，致使治療變得更加困難，死亡率大大增加。乳腺癌治療主要以傳統(tǒng)的手術(shù)治療為主，術(shù)后輔以局部或全身的放射治療、化療及內(nèi)分泌治療。近年來，隨著分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)研究的迅速進展，以及腫瘤發(fā)

3、生基因?qū)W說研究的突飛猛進，給乳腺癌的早期診斷帶來新的希望。乳腺癌在基因治療方面的研究包括抑制原癌基因的功能、恢復(fù)抑癌基因的功能、基因免疫治療、自殺基因治療、多藥耐藥基因治療、抗腫瘤血管形成基因治療、凋亡基因治療、使用溶瘤病毒等。
　　 在對線蟲(C.elegans)的研究中取得的令人振奮的發(fā)現(xiàn)之一就是鑒定出一類調(diào)控發(fā)育的微小RNA(microRNA，miRNA)。在1993年，miRNA首次在秀麗隱桿線蟲中被發(fā)現(xiàn)。現(xiàn)在已知miR

4、(N)A廣泛存在于真核生物細胞內(nèi)，是最大的基因家族之一，大約占到整個基因組的1％，每個miRNA可以調(diào)節(jié)上百個基因的表達，而多個miRNAs可能以同一的方式同時作用于一個靶點來下調(diào)多種蛋白質(zhì)表達。在精細調(diào)控基因表達及生物生長發(fā)育過程方面發(fā)揮著重要作用。miRNA是一類長約22nt的非編碼功能小R(N)A，它在許多生物中都有表達。miRNA原初轉(zhuǎn)錄本(Pri-miRNA)經(jīng)過核內(nèi)和胞質(zhì)中一系列的加工修飾后形成成熟的miRNA。首先，miR

5、NA基因在RNApolymerase(I)(I)作用下，轉(zhuǎn)錄生成pri-miRNA;然后在內(nèi)切酶Drosha作用下，pri-miRNA釋放出60-70nt的前體(Pre-miRNA)，后者具有不完美的發(fā)卡結(jié)構(gòu);最后，Pre-miR(N)A在exportin5作用下進入胞質(zhì)，經(jīng)DICER切割形成成熟miRNA。成熟的miRNA通過與靶基因3'非翻譯區(qū)(3'UTR區(qū))形成不完全配對，從而抑制靶基因翻譯，或形成接近完全的配對，導(dǎo)致靶mRNA降

6、解。最近發(fā)現(xiàn)在人類基因組中，大約有533個miRNA基因座位，數(shù)目大約為蛋白編碼基因的1％，但可以調(diào)控大約1/3的人類基因，說明miRNA是一個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miRNA在很多生物的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，影響細胞發(fā)育、凋亡和增殖，并與疾病發(fā)生相關(guān)。越來越多的證據(jù)表明，許多腫瘤的發(fā)生與發(fā)展與miRNA的異常表達相關(guān)，例如乳腺癌、腦癌、慢性粒細胞白血病、結(jié)腸癌、肝癌和肺癌等。所以一些miR(N)As可能在細胞增殖、分化、凋亡等生物進化過程

7、中起重要作用。Esquela-Kerscher，A等報道，使用miRNAs的基因治療可能是抑制腫瘤細胞增殖的有效方法。如let-7已被證實可以抑制RAS癌基因，miR-15和miR-16可以抑制BCL2基因活性。人類大多數(shù)miRNAs位于mRNA蛋白質(zhì)編碼或非編碼內(nèi)含子區(qū)。其他miRNAs可能遠離染色體轉(zhuǎn)錄區(qū)，在mRNA非編碼外顯子內(nèi)或者在mRNA3UTRs非編碼區(qū)，或與其他miRNAs聚集在一起(如在19號染色體上聚集有54個新發(fā)現(xiàn)的

8、miRNAs)。
　　 miRNA-125b-1就是miRNA其中一員，并且在大多數(shù)乳腺癌細胞系表達下降，推測其發(fā)揮抑癌作用。
　　 Scott，GK等研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-125b-1可通過靶向作用于HER2和HER3mRNA和蛋白質(zhì)水平，抑制乳腺癌細胞生長。Hofmann，MH等通過MDA-MA-435細胞研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-125b-1可以靶向作用于c-raf-1mRNA3'UTR區(qū)，使得C-Raf蛋白以及下游靶

9、點細胞周期蛋白D1含量下降。Li，W等報道，在乳腺癌細胞系，miRNA-125b-1表達增加可以抑制ERK1/2的磷酸化，減低細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲性。并且miRNA-125b-1的靶點有:ras相關(guān)蛋白Rab-13(RAB13)、絲蘇氨酸蛋白激酶13(AURKC)、酪氨酸蛋白激酶受體Tie-1前體(TIE1)、磷酸肌酸3激酶調(diào)節(jié)亞基5(PIK3R5)等，這些結(jié)果顯示，miRNA-125b-1通過蛋白激酶途徑抑制細胞增生。在其他方面，Koma

10、gataS等，miRNA-125b-1前體在MCF-7細胞中可引起維生素D3羥化酶(CYP24)含量下降，推測癌組織中CYP24高表達與miRNA-125b-1含量下降相關(guān)。Smirnov，DA等研究顯示，ATM基因通過調(diào)節(jié)使轉(zhuǎn)錄因子CDX2含量增加，后者作用于miRNA-125b-1使其含量下降，而miRNA-125b-1以TNFSF4為作用靶點。ATM-CDX2-(miRNA-125b-1)-TNFSF4信號通路可能是乳腺癌等疾病患

11、病風(fēng)險增加的調(diào)節(jié)機制。另外，Iorio，MV等，miRNA-125b-1的靶點有癌基因YES、ETS1、TEL、AKT3、生長因子受體FGFR2、絲裂素活化信號轉(zhuǎn)移途徑分支:VTS58653，MAP3K10，MAPK14等。
　　 在前列腺癌，雄激素可以誘導(dǎo)前列腺癌細胞miRNA-125b-1表達增加，后者可以抑制Bak1(凋亡誘導(dǎo)因子)基因的表達，最終刺激癌細胞的生長。miRNA-125b-1在前列腺癌的發(fā)生過程中起癌性作用。

12、而前列腺癌細胞中miRNA-125b-1含量的變化報道不一。
　　 在神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系，miRNA-125b-1可以下調(diào)細胞周期蛋白CDK6、CDC25A，起到抑制細胞增殖的作用，亦可以靶向作用于DGAT1和SGPL1，并對一些凋亡基因有負性調(diào)節(jié)，例如可以使BMF(細胞凋亡相關(guān)蛋白Bc1-2修復(fù)因子)含量下降進而引起B(yǎng)c1-2表達增加，誘導(dǎo)細胞凋亡。另外，很多學(xué)者在探討miRNAs在阿爾茨海默病以及神經(jīng)元分化過程中的

13、作用，其中有miRNA-125b-1的參與。如Wu，L等在誘導(dǎo)鼠P19胚胎細胞分化為神經(jīng)細胞過程中，miR-125a和miRNA-125b-1通過lin-28癌基因的3'非轉(zhuǎn)錄區(qū)的兩個保守反應(yīng)區(qū)，可引起lin-28癌基因表達抑制。
　　 在血液系統(tǒng)，miRNA-125b-1在巨噬細胞分化成熟方面起重要作用，例如，Androulidaki，A等，LPS作用于巨噬細胞后，可以通過LPS-(PI3K/AKT)-miRNAs-TNF來起

14、作用，miRNA-125b-1也參與其中。由此，我們亦可以在乳腺癌細胞系中對此信號通路進行研究。另外，在兒童急性髓細胞性白血病(AML)、小兒急性淋巴細胞白血病、骨髓增生異常綜合癥(MDS)和急性髓性白血病等方面都有學(xué)者探討miRNAs在發(fā)病過程中所起的作用。
　　 在頭頸部鱗癌、未分化甲狀腺癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、泌尿道上皮癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜異位癥、牛皮癬、21三體綜合癥等方面都有miRNAs(包含miRNA-125b-1)

15、的研究。
　　 國內(nèi)在乳腺癌對于miRNA-125b-1研究很少。沈淑蓉等，使用RealtimeRT-PCR方法檢測42例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌及癌旁非腫瘤乳腺組織中miRNA-125b-1的表達，發(fā)現(xiàn)miRNA-125b-1在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中表達異常，可能和乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為有關(guān)。
　　 c-erbB-2原癌基因，又稱HER-2/neu基因，定位于人染色體17q21，編碼一種具有酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性的

16、物質(zhì)p185蛋白，即HER-2/neu蛋白。研究發(fā)現(xiàn)P185蛋白與表皮生長因子受體(EGFR)有高度的同源性，它可能與未知配體結(jié)合后，通過增加蛋白激酶的活性，促進細胞的分裂、增殖和轉(zhuǎn)化。c-erbB2/HER-2/neu基因的擴增和p185erbB2蛋白的過度表達見于多種惡性腫瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺癌。在大多數(shù)乳腺癌患者體中，HER-2/neu呈高表達。因此，以HER-2/neu為靶標(biāo)進行腫瘤治

17、療已受到廣泛關(guān)注。在HER-2/neu蛋白質(zhì)水平上，Genentech公司開發(fā)出針對erbB2的抗體herceptin已經(jīng)被美國FDA批準(zhǔn)在臨床應(yīng)用，對erbB2過表達的腫瘤具有很好的治療效果，herceptin單藥對轉(zhuǎn)移性乳腺癌的有效率約15％，herceptin能誘導(dǎo)erbB2過表達的乳腺癌SKBR3細胞停止于G0/G1期，對SKBR3細胞增殖抑制率達63％。Herceptin被證實具有拮抗生長信號系統(tǒng)、趨化免疫細胞以攻擊腫瘤細胞及

18、增強化療誘導(dǎo)的細胞毒等作用因此，erbB2受體己成為一個新的抗腫瘤靶點。在HER-2/neu基因水平，有人通過RNA干擾(RNAinterference，RNAi)基因阻斷技術(shù)，有人通過癌基因反義寡脫氧核苷酸技術(shù)，都能誘導(dǎo)乳腺癌細胞SKBR-3的凋亡，細胞活力減低，使p185蛋白表達降低。但對miRNA-125b-1作用于HER-2/neu癌基因的研究非常少。傳統(tǒng)抗ErbB2單克隆抗體herceptin與ErbB2受體胞外結(jié)合域進行特異

19、結(jié)合，抑制ErbB2同源二聚化，達到阻斷下游信號傳導(dǎo)的目的。但這種方法對于缺乏細胞外配體結(jié)合域的受體(P95ErbB2)以及ErbB2異源二聚體(ErbB2/ErbB3、ErB1/ErbB2、ErBI/ErbB3)無效。而miRNA-125b-1可與c-erbB-2癌基因mRNA3'UTR區(qū)特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制ERBB2。
　　 本研究通過使用miRNA-125b-1作用于SKBR-3細胞(Her2陽性)，來探討mi

20、RNA-125b-1對Her2基因表達及對細胞放化療敏感性的影響。全新的作用機制決定了miRNA-125b-1更能從mRNA水平阻斷ErbB2受體信號傳到通路，達到抑制腫瘤細胞的作用。這為我們對ErbB2陽性的乳腺癌的治療提供了新方法。本研究擬合成miRNA-125b-1，利用脂質(zhì)體將miRNA-125b-1導(dǎo)入乳腺癌SKBR-3細胞中，抑制或封閉ErbB2基因的表達，從而達到抑制腫瘤的生長、增值、分化和誘導(dǎo)其凋亡的目的。同時檢測miR

21、NA-125b-1是否能夠提高乳腺癌對放療的敏感性。另外，miRNA-125b-1具有增強化療效果的作用，應(yīng)用針對Her2的miRNA-125b-1，同時應(yīng)用紫杉醇等化療藥物，檢測是否能夠提高乳腺癌對紫杉醇等化療藥物的敏感性。這種腫瘤治療方法把小干擾RNA同放化療進行了完美的結(jié)合，具有極大的臨床研究價值。對miRNA-125b-1應(yīng)用于Her2陽性的乳腺腫瘤提供了理論基礎(chǔ)，也為應(yīng)用于其他實體腫瘤的治療提供重要的參考價值。
　　

22、目的:
　　 探討miRNA-125b-1對乳腺癌SKBR-3細胞放化療敏感性的影響，及其對靶基因HER-2蛋白表達的影響。
　　 方法:
　　 合成miRNA-125b-1并通過lipofectamine(T)2000轉(zhuǎn)染SKBR-3細胞，分別用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)和WesternBlot法檢測HER-2m

23、RNA和蛋白質(zhì)表達水平的變化;流式細胞儀檢測細胞周期;四甲基偶氮唑藍(methylthiazolyltetrazolium，MTT)法檢測細胞增殖抑制率;經(jīng)不同劑量X線照射后，平板克隆形成實驗計算細胞存活率，用單擊多靶數(shù)學(xué)模型進行曲線擬合作圖，求曲線參數(shù)(D0)、(D4)和(N)值，比較細胞放射敏感性的變化。MTT法觀察miR(N)A-125b-1-1對紫杉醇作用于SKBR-3細胞增殖的抑制情況。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分

24、析。計量資料用(x)±s表示，使用ShapiroWilk法進行正態(tài)分布檢驗，P＞0.05為滿足正態(tài)分布;使用Leven'test進行方差齊性檢驗，P＞0.05為滿足方差齊性;在方差不齊時，選擇近似F檢驗Welch法方差分析。對細胞周期實驗結(jié)果做秩和檢驗后再調(diào)整檢驗水準(zhǔn)做兩兩比較;細胞增殖實驗結(jié)果使用Mauchly'stestofsepericity進行球形檢驗，球形檢驗統(tǒng)計量P＞0.05不拒絕球形假設(shè)，并采用重復(fù)測量方差分析;RT-PC

25、R和Westernblot定量結(jié)果采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 miRNA-125b-1轉(zhuǎn)染后的SKBR-3細胞中HER-2mRNA(F=447.779,P=0.000)和蛋白質(zhì)水平顯著下降(F=10.073，P=0.012);轉(zhuǎn)染后的SKBR-3細胞出現(xiàn)了G2M期阻滯;miRNA-125b-1組細胞增殖抑制率與陰性對照組相比，差異有顯著性(F=139.590，P=0.000)

26、;曲線擬合后顯示，轉(zhuǎn)染后的細胞(D0=1.866，Dq=2.681，N=4.207)與對照組(D0=2.513，Dq=4.097，N=5.107)相比DO，Dq和N值均下降(SER=1.347)，提示細胞放射敏感性增加。用miRNA-125b-1處理組細胞的IC50與未處理組相比下降2.69倍(P＜0.05)，由此表明，miRNA-125b-1可增加乳腺癌SKBR-3細胞對紫杉醇的敏感性。
　　 結(jié)論:
　　 miRNA