SRB1、ITGB2基因單核苷酸多態(tài)性與冠心病的相關性研究.pdf

1、背景:
　　冠心病是一種由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用導致的復雜疾病，是世界范圍內(nèi)死亡和致殘的首要原因之一。脂代謝異常和炎癥是冠心病發(fā)生、發(fā)展的兩大機制，也是近年來冠心病研究的熱點。B類1型清道夫受體(scavenger receptor class B type1，SRB1)是最主要的高密度脂蛋白(HDL)受體，既能介導肝臟對高密度脂蛋白中膽固醇脂的選擇性攝取，又能促進外周組織細胞內(nèi)游離膽固醇轉(zhuǎn)運至HDL，從而保持膽固醇代謝的平衡

2、并防止游離膽固醇在動脈壁中堆積。SRB1的缺失可導致動脈壁內(nèi)膽固醇平衡紊亂以及脂質(zhì)在動脈壁大量沉積和動脈硬化癥的發(fā)生。炎癥是動脈粥樣硬化性疾病發(fā)病的另一重要機制，炎癥反應中白細胞的粘附、趨化等過程的基礎是細胞黏附和黏附分子的作用。整合素β2（ITGB2，integrin beta2），即CD18，是黏附分子中整合素家族的重要成員。在前期的差異蛋白質(zhì)組學研究中，我們發(fā)現(xiàn)，冠心病患者心外膜脂肪組織中ITGB2在表達水平較非冠心病患者明顯上調(diào)

3、（1.6倍），而在相應的皮下脂肪組織中的表達水平確明顯下調(diào)（0.1倍）。提示ITGB2可能通過參與炎癥細胞與內(nèi)皮細胞之間的粘附、炎癥細胞趨化等過程，從而在動脈粥樣硬化形成的起始階段發(fā)揮作用。冠心病是一種復雜的多基因遺傳病，從遺傳學的角度研究冠心病的發(fā)病機制，可能為冠心病提供一種新的診療手段。
　　目的:
　　本研究的目的在于，對中國北方漢族人群SRB1和ITGB2基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)進行分析，探討這兩個基因SNPs

4、位點的等位基因頻率、基因型頻率與冠心病發(fā)病的相關性;同時探索SNPs位點與研究對象的糖、脂代謝指標的相關性。為闡明冠心病的遺傳機制、評估冠心病的病變程度和預后提供新的指標。
　　方法:
　　1、研究對象
　　研究對象來自北京協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科冠心病研究數(shù)據(jù)庫，所有研究對象均于我院行冠狀動脈造影檢查，并進行了詳細的病史采集和血生化指標收集。根據(jù)我院冠狀動脈造影檢查結果進行診斷，左主干、右冠、左前降支、左回旋支中有一支以上狹窄

5、≥50％診斷為冠心病。根據(jù)冠脈造影結果進行分組，冠狀動脈造影結果證實本研究入選以上血管狹窄≥75％患者為冠心病組，冠狀動脈造影結果未見異常或狹窄＜25％作為非冠心病組。從冠心病研究數(shù)據(jù)庫中篩選出性別、年齡、BMI、糖尿病患者比例、血脂異?；颊弑壤軌蚱ヅ涞幕颊咦鳛檠芯繉ο蟆?br>　　2、篩選SNPs位點
　　(1)在haploview中挑選基因的標簽SNP，選擇其中位于基因功能區(qū)（如啟動子區(qū)、外顯子區(qū)、3' UTR或5'UTR）

6、的SNPs位點，之后在Hapmap中查找目標SNP在中國人群中的MAF值（最小等位基因頻率），以MAF大于0.05為原則;
　　(2)依據(jù)全基因組關聯(lián)研究(GWAS)結果及國內(nèi)外文獻報道，篩選曾經(jīng)報道過陽性結果或趨勢的SNPs位點。
　　3、SNP檢測方法
　　使用OMEGA公司提供的全血基因組DNA提取試劑盒提取DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳進行DNA質(zhì)檢，之后利用Sequenom MassARRAY SNP檢測平臺進行

7、檢測。檢測過程主要包括引物設計及合成、PCR擴增反應、SAP純化反應、單堿基延伸反應、質(zhì)譜檢測（基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜）分析，檢測結果使用TYPER4.0軟件(sequenom)分型并輸出結果。
　　4、統(tǒng)計分析方法
　　基因型頻率分布的Hardy.Weinberg平衡(HWE)檢驗、最小等位基因頻率(Minorallele frequency，MAF)、“病例-對照”關聯(lián)研究數(shù)據(jù)分析應用Plink軟件;不同基因

8、型間計量數(shù)據(jù)的比較應用SPSS17.0，其中連續(xù)變量使用單因素方差分析，分類變量使用卡方分析;單體型分析應用Haploview4.0軟件，P＜0.05認為統(tǒng)計學有顯著性差異。
　　結果:
　　1、一般臨床資料
　　冠心病組496例，其中男性256人，女性244人，平均年齡為60.19±9.8歲。正常對照組367例，其中男性181人，女性186人，平均年齡為59.39±11.00歲。兩組之間性別、年齡、BMI、糖尿病患者

9、比例、血脂異?；颊弑壤裏o顯著性差異。
　　2、Hardy-Weinberg平衡檢驗
　　SRB1基因的三個SNP位點rs838880、rs5888、rs5889和ITGB2基因的三個SNP位點rs235326、rs2070947、rs2070946均符合Hardy-Weinberg平衡，樣本具有較好的代表性。
　　3、SNPs位點的“病例-對照”關聯(lián)分析
　　分別對SRB1基因的三個SNP位點rs838880、r

10、s5888、rs5889和ITGB2基因的三個SNP位點rs235326、rs2070947、rs2070946的等位基因頻率、基因型頻率在冠心病組和非冠心病組進行差異性檢驗，并通過基因模型模擬進行分析。SRB1基因rs838880位點(C/T)等位基因頻率和基因型頻率在兩組間統(tǒng)計學有顯著性差異，P值分別為0.017、0.0028。通過基因模型模擬，當?shù)任换駽為隱性遺傳時，即基因型為CC型時，與另外兩種基因型(CT型+TT型)相比，兩

11、組之間的基因型頻率統(tǒng)計學有顯著性差異，P值為0.000672。在冠心病組與非冠心病組間SNPs位點隱性模型的關聯(lián)分析中，ITGB2基因的rs2070947位點(GG vs CA+AA)在兩組間統(tǒng)計學有顯著性差異(p=0.03），基因型為GG型的人群冠心病的發(fā)生率為73％，而基因型為GA或AA時，冠心病的發(fā)生率為56％。
　　4、不同基因型間計量和計數(shù)資料的比較
　　對上述SNPs位點三個基因型間臨床及血清代謝指標進行比較，S

12、RB1基因rs5888位點三個基因型（AA型、AG型、GG型）間，血脂異常病史、LPA差異有統(tǒng)計學意義（P值均為0.03），三種基因型中，AA型有高脂血癥病史的人數(shù)明顯少于另外兩種基因型，AA型LPA水平明顯低于另外兩種基因型。ITGB2基因rs235236位點三個基因型（AA型、AG型、GG型）間，高血壓病史、HDL、APOA1統(tǒng)計學有顯著性差異，AA型HDL水平高于另外兩種基因型，AG型APOA1水平低于另外兩種基因型。ITGB2基

13、因rs2070947位點三個基因型（GG型、GA型、AA型）間，TG統(tǒng)計學有顯著性差異(P=0.01)，GA型TG水平明顯高于另外兩組。rs2070946位點三個基因型（CC型、CT型、TT型）間，APOA1、hsCRP統(tǒng)計學有顯著性差異(P值分別為0.01、0.02)。CT型APOA1及hsCRP的水平均明顯高于另外兩個基因型的人群。
　　結論:
　　SRB1基因的rs838880位點(C/T)與冠心病的發(fā)生有相關性，基因

14、型為CC型的人群相對于具有其他兩種基因型的人群，其冠心病的發(fā)生風險明顯降低，C等位基因可能對冠心病的發(fā)病起保護作用。SRB1基因rs5888位點與脂質(zhì)代謝有關，A等位基因可能對脂代謝異常起保護作用。ITGB2基因的rs2070947位點，基因型為GG型的人群冠心病的發(fā)生率為(73％)明顯高于基因型為GA或AA型(56％)，GG基因型可能是冠心病發(fā)病的危險因素。ITGB2基因rs2070946位點基因型為CT型的人群hsCRP水平升高，C