血清CCL17水平及CCL17基因單核苷酸多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　冠狀動脈性心臟病（coronary artery disease，CAD）簡稱冠心病，其主要病理基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。AS的發(fā)病機制尚不完全清楚，炎性反應(yīng)的作用逐漸受到重視。CC趨化因子配體17(CC chemokine ligand17，CCL17)屬于CC趨化因子亞家族，AS斑塊內(nèi)的CCL17可以募集炎性細(xì)胞，同時抑制具有抗炎作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cel

2、ls，Tregs)的功能，使促炎抗炎反應(yīng)失衡，斑塊擴大且變得不穩(wěn)定，可能具有促進(jìn)CAD的作用。但是人群中CCL17與CAD的關(guān)系尚不明確，本研究擬探索人血清CCL17水平及CCL17單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與CAD發(fā)病的關(guān)系，并對關(guān)聯(lián)分析陽性的SNP位點進(jìn)行功能分析，以期為今后篩查CAD高危人群及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點提供線索。
　　材料與方法：
　　1.連續(xù)入選201

3、3年1月至2013年12月于北京協(xié)和醫(yī)院行冠狀動脈造影檢查者作為研究人群，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清CCL17水平并分析其與CAD的相關(guān)性。
　　2.應(yīng)用HapMap數(shù)據(jù)庫和Haploview4.2軟件對CCL17基因的SNPs進(jìn)行連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)分析，篩選出標(biāo)簽SNP以覆蓋整個CCL17基因的多態(tài)性

4、信息。
　　3.應(yīng)用Taqman探針方法對研究人群的標(biāo)簽SNPs進(jìn)行基因分型，分析其與CAD及血清CCL17水平的相關(guān)性。
　　4.通過生物信息學(xué)軟件TRANSFAC和Jaspar對關(guān)聯(lián)分析陽性的SNP位點rs223828進(jìn)行功能預(yù)測。
　　5.rs223828位點被預(yù)測可能與轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1（activator protein，AP-1）結(jié)合，具有潛在轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，克隆rs223828位點所在區(qū)域序列，構(gòu)建pGL3

5、-Basic重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析轉(zhuǎn)錄活性。
　　6.應(yīng)用凝膠遷移(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)及超遷移(Super-shift)實驗在體外水平分析rs223828位點C等位基因及T等位基因與AP-1結(jié)合能力的差異。
　　7應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）及實時定量PCR技

6、術(shù)在體內(nèi)水平分析rs223828位點C等位基因及T等位基因與AP-1結(jié)合能力的差異。
　　結(jié)果：
　　1.共813例CAD及158例非CAD個體入選本研究，CAD患者血清CCL17水平顯著高于非CAD患者，且血清CCL17水平隨病情由輕到重具有線性升高的趨勢，與代表冠狀動脈狹窄程度的Gensini評分(Gensini score，GSS)呈正相關(guān)關(guān)系。
　　2.選取了CCL17基因的5個標(biāo)簽SNP：rs223895、r

7、s4784805、rs9302690、rs223899及rs223828。
　　3.共檢測了794例CAD及153例非CAD個體標(biāo)簽SNP的基因型，發(fā)現(xiàn)rs223899位點的次要等位基因T以及rs223828位點的次要等位基因T是CAD的危險因素，其中rs223828位點的T等位基因與外周血CCL17水平升高相關(guān)。
　　4.TRANSFAC和Jaspar軟件分析提示rs223828位點是AP-1的潛在結(jié)合位點，其中T等位基因

8、更易與AP-1結(jié)合，從而促進(jìn)CCL17基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　5.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻靼琓等位基因的重組質(zhì)粒表達(dá)的熒光素酶顯著高于包含C等位基因的重組質(zhì)粒，T等位基因可能具有增強轉(zhuǎn)錄的特性。
　　6.EMSA實驗表明包含T等位基因的生物素探針與核蛋白中的某一成分的結(jié)合能力高于包含C等位基因的探針，Super-shift實驗與Chip實驗實驗分別在體外和體內(nèi)水平證明rs223828位點多態(tài)性影響了轉(zhuǎn)錄因子AP-1的結(jié)合。

9、
　　結(jié)論：
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)人血清CCL17水平與CAD發(fā)病及嚴(yán)重程度相關(guān)，該基因的SNP位點rs223828可能通過影響轉(zhuǎn)錄因子AP-1的結(jié)合進(jìn)而影響CCL17的表達(dá)，從而影響CAD的易感性。本研究尚存在一些不足之處，首先血清CCL17水平與CAD發(fā)病的因果關(guān)系需通過前瞻性隊列研究進(jìn)一步證實，另外rs223828位點的功能尚未在細(xì)胞及動物實驗中證實。在之后的工作中，準(zhǔn)備開展前瞻性隊列研究以及細(xì)胞和動物實驗，為篩查CAD