DAZL基因單核苷酸多態(tài)性與弱畸精子癥的相關(guān)性研究.pdf

1、研究表明，不孕不育問(wèn)題困擾了近15％的育齡夫婦。近年來(lái)其發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢(shì)。有資料顯示，目前世界上約達(dá)到25％的夫婦存在生育障礙，其中因男性因素所致的不育約占50％。影響男性不育的因素眾多，其中精子活力不足及精子形態(tài)異常是非常重要的病因。在一項(xiàng)關(guān)于成年男性不育患者的精液分析中91.07％的不育男性都有正常的精液量，但有正常精子活力的患者只有6.3％，細(xì)胞形態(tài)不正常的患者竟高達(dá)62％。另一項(xiàng)關(guān)于精液分析的研究顯示，81％的男性不育患

2、者存在精子活力不足，其中合并有畸精子癥和/或少精子癥者約63％，特發(fā)性弱精子癥的患者約20％。
　　 精子運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力來(lái)自于精子尾部位置的鞭毛的擺動(dòng)而產(chǎn)生的向前的動(dòng)力。按目前觀點(diǎn)來(lái)說(shuō)，滑動(dòng)模式是精子進(jìn)行運(yùn)動(dòng)的主要模式。這種模式的基本原理是:在三磷酸腺苷(ATP)的啟動(dòng)下，精子鞭毛軸絲的雙聯(lián)微管之間的滑動(dòng)(A微管的兩行支臂重復(fù)脫離并再次附著與相鄰雙微管內(nèi)的B微管上的結(jié)合位點(diǎn))產(chǎn)生一種縱向力，并被各種和雙聯(lián)微管相關(guān)的附屬結(jié)構(gòu)形成的滑動(dòng)

3、抗力轉(zhuǎn)化為橫向的彎曲動(dòng)力，引起波浪狀形成并傳播。精子中存在的大量線粒體所產(chǎn)生的ATP則是精子運(yùn)動(dòng)的主要能量來(lái)源，在激活精子鞭毛系統(tǒng)中起重要作用。這一過(guò)程的參與調(diào)控的主要因素有如下幾方面:(1)激酶及磷酸化體系(環(huán)腺苷酸(cAMP)-蛋白激酶-磷蛋白磷酸酶體系、二脂酰甘油(DG)-蛋白激酶C(PKC)體系、酪氨酸蛋白激酶(TPK)系統(tǒng)）:精子運(yùn)動(dòng)的重要調(diào)控機(jī)制是蛋白磷酸化。精子尾部特異蛋白酪氨酸磷酸化缺陷與其精子活力低下有極為密切的關(guān)系。

4、(2)活性氧族(Reactive Oxygen Species)及超氧化物岐化酶(SOD): ROS主要有O2-、H2O2、OH-等，由精子及精液中的白細(xì)胞產(chǎn)生。在低濃度時(shí)，環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶信號(hào)通路可被活性氧族誘導(dǎo)而使精子活力增加。而精子的細(xì)胞膜則會(huì)因活性氧族濃度高而發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，進(jìn)而ATP的合成減少，導(dǎo)致精子活力的減弱。SOD可清除ROS抑制細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)使精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能保持正常(3)精子內(nèi)鈣離子水平:存在于精

5、子尾部潛在的鈣通道勢(shì)能感受器(Transient receptor potential calcium channels)通過(guò)增加鈣離子的容量而精子活力提高。(4)精漿的滲透壓:當(dāng)精漿滲透壓較低時(shí)，精子滲透壓敏感性鈣通道可被激活從而誘使鈣離子內(nèi)流，以提高精子活力。(5)一氧化氮(Nitric oxide，NO):作為細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的信使，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)NO供體（硝普鈉）可使倉(cāng)鼠精子活力顯著提高，而一氧化氮合酶(NOS)抑制劑(L-NAME)

6、則會(huì)表現(xiàn)出相反的作用。(6)免疫因子:在男性精液中，由免疫因素導(dǎo)致過(guò)量的抗精子抗體形成可致使精子凝集進(jìn)而影響精子活力。
　　 引起精子活力不足的因素眾多，包括:精液液化異常，生殖系統(tǒng)感染，內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，精索靜脈曲張，免疫因素，微量元素的缺乏，吸煙、飲酒等不良的生活習(xí)慣，染色體異常，先天性Kartagener's綜合征等;影響精子形態(tài)的因素包括:1、微生物感染;2、環(huán)境污染如鉛、殺蟲(chóng)劑等、生活習(xí)慣等理化因素;3、內(nèi)分泌因素，睪酮

7、/雌激素比例，抑制素B，F(xiàn)SH等。精子形態(tài)與精子運(yùn)動(dòng)和活力密切相關(guān)，任何形態(tài)上的缺陷都可能導(dǎo)致其功能下降，引起男性不育。臨床上將精子活力不足同時(shí)正常形態(tài)精子百分率低于正常值者稱(chēng)為弱畸精子癥。
　　 絕大多數(shù)疾病的發(fā)生是遺傳易感性與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。具有不同遺傳背景的個(gè)體，在相同的環(huán)境暴露下，其對(duì)疾病的反應(yīng)性也不完全相同。因此，對(duì)于精子活力不足、精子形態(tài)異常等因素所導(dǎo)致的不育，不單需要關(guān)注環(huán)境因素的影響，在遺傳水平上的差異同

8、樣可能影響個(gè)體對(duì)弱精子癥以及畸精子癥的易感性。多種遺傳因素被發(fā)現(xiàn)會(huì)對(duì)精子活力以及精子形態(tài)造成影響，包括:基因的突變、基因缺失、基因的堿基替換、染色體異常等。
　　 近年來(lái)，與男性不育癥及精子缺陷相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism，SNP)也成為研究熱點(diǎn)。越來(lái)越多的單核苷酸多態(tài)性SNPs被報(bào)道，提示相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性SNPs可能與男性不育癥及精子活力不足和精子形態(tài)異常存在相關(guān)

9、性。
　　 DAZ(the deleted in azoespermia)基因家族由DAZ、DOULE及DAZL(deletedin azoospermia like)基因構(gòu)成，這三個(gè)基因均只在生殖細(xì)胞中表達(dá)。在生殖細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中DAZ家族成員起重要的作用。定位于常染色體3p24的DAZL基因與DAZ基因具有高度的同源性，其cDNA編碼區(qū)83％的基因序列與DAZ基因相同，并且二者均編碼RNA結(jié)合蛋白但與DAZ基因不同，DAZL

10、基因是單拷貝基因。Ruggiu在敲除了DAZL基因的小鼠睪丸中找不到任何精子，并且睪丸組織結(jié)構(gòu)紊亂，生精小管數(shù)量極少。雜合子小鼠雖然可找到精子，但與野生型小鼠相比，雜合子小鼠精子總數(shù)少并且精子畸形率高，其中大部分為頭部畸形。Vogel等將DAZL基因缺失小鼠模型轉(zhuǎn)入人類(lèi)DAZ和DAZL基因，可以使小鼠產(chǎn)生精母細(xì)胞，但基本都處在細(xì)線期和偶線期，而不能進(jìn)入分裂期或分裂后期，說(shuō)明DAZ和DAZL對(duì)于建立生殖細(xì)胞群和使其進(jìn)入減數(shù)分裂期起重要作用

11、。
　　 DAZL基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與精子發(fā)生的相關(guān)性已被許多學(xué)者所報(bào)道。DAZL基因的兩個(gè)SNP，A260G及A386G，分別位于第2外顯子和第3外顯子，這兩個(gè)SNP由A到G的改變分別造成第12位及第54位的蘇氨酸變?yōu)楸彼?T12A，T54A)，其中，T54A位于RNA識(shí)別基序。Teng等在臺(tái)灣不育男性患者的研究中，認(rèn)為單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)SNP A260G、SNP A386G與男性不育具有顯著相關(guān)性，其表現(xiàn)型可為少精子

12、癥甚或是唯支持細(xì)胞綜合征。Tschanter等對(duì)高加索男性人群的研究發(fā)現(xiàn)在正常生育組中24.2％可檢測(cè)到SNP A260G多態(tài)性AG，但整個(gè)分布頻率在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比較并無(wú)顯著性差異。而我國(guó)學(xué)者聞小慧等對(duì)東北區(qū)域不育癥男性患者和正常生育男性的研究發(fā)現(xiàn)SNP A386G多態(tài)性與中國(guó)東北區(qū)域男性人群不育不存在相關(guān)性，SNP A260G多態(tài)性與男性人群不育是否存在相關(guān)無(wú)明確定論。
　　 本研究的主要研究方法、內(nèi)容及結(jié)論包括以下幾個(gè)方

13、面:
　　 目的:
　　 探討廣東漢族人群中DAZL基因（deleted in azoospermia like）A260G及A386G單核苷酸多態(tài)性(SNP)與弱精子癥伴畸精子癥男性不育的關(guān)系。
　　 方法:
　　 1.研究對(duì)像按照1999年WHO的診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇精液分析為精子活力不足且伴精子形態(tài)異常的男性弱畸精子癥患者。所有患者均為婚后未行避孕措施1年以上而未能生育，常規(guī)體格檢查未發(fā)現(xiàn)明顯異常，均排除

14、生殖道感染、系統(tǒng)性疾病病史、精索靜脈曲張、精液液化異常、不良生活習(xí)慣及激素水平異常等可能導(dǎo)致精子活力下降的因素，配偶檢查未見(jiàn)明顯異常。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)為:任意一次精液檢查提示精子活力正常且正常形態(tài)精子百分率及其他精液參數(shù)無(wú)明顯異常的志愿者。所有納入研究的標(biāo)本收集前均口頭告知患者，并獲取其知情同意。
　　 2.對(duì)收集的弱畸精子癥患者及正常對(duì)照組的精液樣本進(jìn)行精液常規(guī)、精子活力及形態(tài)學(xué)分析。待樣本完全液化后每份取10ul采用計(jì)算機(jī)輔助

15、精液分析系統(tǒng)(CASA，computer-assisted semen analysis)分析精子濃度、存活率、活動(dòng)力、動(dòng)態(tài)參數(shù)等;每份另取一滴精液樣本，采用Diff-Quick快速染色法計(jì)算正常形態(tài)精子百分率。經(jīng)常規(guī)及形態(tài)學(xué)分析后的每份精液樣本采用50％Percoll一層離心方法分離純化精子，并將精子細(xì)胞放置于-70℃凍存。
　　 3.采用細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取精子DNA，并檢測(cè)，合格的DNA放于-20℃保存。

16、　　 4.采用Sequenom MassARRAY Design4.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，利用SequenomMassARRAY(R) SNP分型技術(shù)（包括PCR擴(kuò)增、蝦堿性磷酸酶處理、單堿基延伸反應(yīng)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)等方面）對(duì)DAZL基因A260G、A386G多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。
　　 5.病例組和對(duì)照組間基本參數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，DAZL基因A260G、A386G基因型頻率分布差異比較采用x2檢

17、驗(yàn)，以P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.本研究弱畸精子癥不育患者173例，精子活力及正常形態(tài)精子百分率正常的志愿者175例。
　　 2.弱畸精子癥實(shí)驗(yàn)組在精子濃度、A級(jí)精子（快速直線前向運(yùn)動(dòng)精子）比例、A+B級(jí)精子（前向運(yùn)動(dòng)精子）比例及正常形態(tài)精子百分率方面與正常對(duì)照組相比較顯著降低，差異具有顯著性。而在年齡、禁欲天數(shù)、精液量等各項(xiàng)指標(biāo)兩組參數(shù)比較無(wú)明顯差異。
　　 3.在病例組與對(duì)照

18、組中，DAZL基因A260G多態(tài)性位點(diǎn)均僅檢測(cè)到野生基因型AA，而未檢測(cè)到突變型AG或GG。
　　 4.在病例組與對(duì)照組中，DAZL基因A386G多態(tài)性位點(diǎn)均僅檢測(cè)到野生基因型AA，而未檢測(cè)到突變型AG或GG。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過(guò)對(duì)173例弱畸精子癥患者及175例精子活力及正常形態(tài)精子百分率正常的志愿者DAZL基因A260G、A386G兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)廣東地區(qū)漢族人群此兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)僅存在野

19、生基因型AA，均未發(fā)現(xiàn)突變基因型。
　　 2.關(guān)于DAZL基因A386G多態(tài)性位點(diǎn)，本次研究結(jié)果與臺(tái)灣地區(qū)人群發(fā)現(xiàn)DAZL基因A386G多態(tài)性位點(diǎn)雜合子AG，并認(rèn)為該多態(tài)性位點(diǎn)可增加精子生成障礙的易感性結(jié)果不同，而對(duì)高加索、意大利、日本及我國(guó)東北等地區(qū)人群的研究也未發(fā)現(xiàn)DAZL基因A386G多態(tài)性位點(diǎn)，和本次結(jié)果相同。對(duì)于DAZL基因A260G多態(tài)性位點(diǎn)，在日本及高加索人群可檢測(cè)到其多態(tài)性，但在正常組和不育人群中無(wú)顯著性差異，我