丹參對阻塞性黃疸大鼠肝臟、腎臟細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機制的研究.pdf

1、阻塞性黃疸(OJ)是臨床上常見并發(fā)癥，膽道系統(tǒng)的良、惡性梗阻、手術(shù)損傷等均可導(dǎo)致OJ并隨即出現(xiàn)嚴(yán)重的多臟器損傷。目前認(rèn)為阻塞性黃疸(OJ)可誘導(dǎo)肝臟、脾臟、淋巴細(xì)胞、胃腸黏膜以及心臟血流動力學(xué)障礙等功能損害。但是，OJ時引起多臟器損害的內(nèi)在機制還不清楚。普遍認(rèn)為，內(nèi)毒素、炎癥介質(zhì)、以及膽汁酸升高誘發(fā)OJ時肝或其他器官損傷。此外，高膽管內(nèi)壓力和門靜脈壓力，也是造成這一傷害的重要因素。近年來隨著細(xì)胞凋亡研究的深入，已發(fā)現(xiàn)許多肝膽系統(tǒng)疾病與細(xì)

2、胞凋亡規(guī)律失常有關(guān)，細(xì)胞凋亡在維持肝膽系統(tǒng)正常生理狀態(tài)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著十分重要的作用。研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡參與OJ多臟器功能損傷的發(fā)病機制有兩種：一是受基因調(diào)控，另一種是受非基因調(diào)控；基因調(diào)控又分為直接調(diào)控和間接調(diào)控，前者包括p53、Bax、Fas-Fasl、Bcl-2等，后者如TGF、TNF、NF-1B等。其中，Bax是一種可溶性蛋白質(zhì)，正常情況下以單體形式定位于細(xì)胞漿，當(dāng)收到凋亡刺激時構(gòu)象發(fā)生變化，從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體并與線粒體外膜結(jié)

3、合，直接降低線粒體外膜穩(wěn)定性或與Bcl-2結(jié)合成異源二聚體的結(jié)構(gòu)，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。NF-kB是一種廣泛存在于多種細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的具有細(xì)胞核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)因子，是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白Rel家族成員之一，參與多種炎性因子基因表達(dá)的調(diào)控及細(xì)胞凋亡等多種病理生理過程。當(dāng)機體細(xì)胞處于氧自由基水平升高、缺血-再灌注損傷、內(nèi)毒素血癥等應(yīng)激狀態(tài)下，I-kB可使NF-kB活化易位進(jìn)入細(xì)胞核并結(jié)合于靶基因特異的啟動子區(qū)域的KB基因序列結(jié)合，從而啟動

4、促炎癥分子基因的轉(zhuǎn)錄核蛋白質(zhì)的合成，引起TNF-α、IL-6mRNA等的強烈表達(dá)，產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，同時間接促使凋亡細(xì)胞增加，加速對臟器細(xì)胞的毒性作用并最終出現(xiàn)多器官功能損傷。有實驗證實Bax蛋白、NF-kB蛋白明顯高表達(dá)時，梗阻性黃疸大鼠肝腎組織細(xì)胞凋亡明顯增多?，F(xiàn)今研究發(fā)現(xiàn)，NF-kB亞單位的種類及數(shù)量在細(xì)胞凋亡中起著決定性的作用，當(dāng)c-RelA亞型表達(dá)增加時，則促進(jìn)凋亡的發(fā)生。藥物治療OJ多臟器功能損害能否通過調(diào)控臟器細(xì)胞凋

5、亡從而獲得療效正引起研究者的興趣。丹參是一種傳統(tǒng)中藥，通常用于活血治療。丹參是野生丹參根的提取物，主要活性成分包括丹參素，丹酚酸以及丹參酮等，能夠起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，對抗炎癥，防止脂質(zhì)過氧化和鈣超載的作用。研究表明，丹參治療OJ大鼠時通過降低內(nèi)毒素水平、減少炎癥介質(zhì)等已經(jīng)得到普遍認(rèn)同的機制，發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞，維護(hù)肝功能，以及減少對腎皮質(zhì)和腎功能損害的作用。但是丹參是否通過抗細(xì)胞凋亡的分子機制起到治療作用，尚無進(jìn)一步研究。
　　 目的

6、：通過觀察丹參對阻塞性黃疸大鼠(OJ)肝臟細(xì)胞、腎臟細(xì)胞凋亡和Bax、NF-kB蛋白表達(dá)的影響，探討丹參對肝臟、腎臟的保護(hù)機制。
　　 方法：①取雄性清潔級健康SD大鼠180只進(jìn)行實驗(體重270～330g)。購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[實驗動物許可證號：SCXK(滬)2007-0005]。于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心屏障系統(tǒng)實驗室飼養(yǎng)[實驗動物許可證號：SYXK(浙)2007-0003]。大鼠實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，術(shù)前

7、禁食12 h，自由飲水。②將大鼠隨機均分為假手術(shù)組(n=60)、模型組(n=60)、丹參治療組(n=60)。假手術(shù)組僅游離大鼠膽總管而不結(jié)扎，然后分層關(guān)腹。模型組和丹參治療組游離大鼠膽總管后用絲線雙重結(jié)扎膽總管近端，并切斷膽總管，分層關(guān)腹。丹參治療組組按每只0.2ml/100g/d腹腔內(nèi)注射丹參注射液，而假手術(shù)組、模型組每日注射等量的生理鹽水。按術(shù)后不同時間段各組分為OJ7d、14d、21d、28d組(n=15)。③記錄術(shù)后各相應(yīng)時點大

8、鼠的一般情況，包括大鼠活動度、精神狀況、大小便顏色及是否改變、眼白及皮毛染色有無改變，死亡率等。④檢測各組、各時間點血清TBIL、DBIL、γ-GT，BUN、CREA含量，通過對大體標(biāo)本肉眼觀察、光鏡法及電鏡法觀察各組、各時間點肝臟、腎臟組織病理改變特征，判斷大鼠阻塞性黃疸模型建立是否成功，以及運用丹參治療后與模型組一般情況、血清指標(biāo)、病理變化來判斷治療效果。⑤運用組織芯片技術(shù)制作肝、腎組織微陣列切片。采用組織微陣列片制作機(Beech

9、er Instruments，USA)制備肝、腎的組織微陣列片，將100個直徑2毫米的小組織樣本，以陣列方式包埋于同一塊20mm×45 mm的石蠟塊中，再進(jìn)行切片，用于同一實驗指標(biāo)的研究。⑥在制作完成的肝腎組織微陣列切片上通過DNA缺口原位末端標(biāo)記法(TUNEL法)檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)。在微陣列切片上進(jìn)行TUNEL染色，高倍鏡下(400倍)觀察凋亡細(xì)胞的分布。每張切片隨機選擇5-10個高倍視野，計數(shù)1000個細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞個數(shù)，用百分?jǐn)?shù)表

10、示，計算凋亡指數(shù)( AI)，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100％。本部分工作在陜西超英生物科技有限公司完成。⑦在制作完成的肝腎組織微陣列切片上通過免疫組化檢測組織切片中Bax、NF-kB c-RelA蛋白表達(dá)水平。在微陣列切片上采用二步EnVision法，計分標(biāo)準(zhǔn)如下：1)接著色細(xì)胞染色強度計分為：細(xì)胞呈陰性染色為-；染色弱，陽性細(xì)胞呈淡黃色為+；染色中等，陽性細(xì)胞呈棕黃色為++；染色強，陽性細(xì)胞呈棕褐色為++。2)陽性細(xì)胞數(shù)(面積)：

11、無陽性細(xì)胞數(shù)為-；陽性細(xì)胞數(shù)<25％為+；陽性細(xì)胞數(shù)25～50％為++；陽性細(xì)胞數(shù)>50％為++。
　　 結(jié)果：⑴假手術(shù)組21d死亡1只，其余時間點無死亡；模型組7d死亡2只，14d死亡4只，21d死亡4只，28d死亡7只；丹參治療組7d無死亡，14d死亡3只，21d死亡2只，28d死亡4只。7d三組間死亡率無統(tǒng)計學(xué)差異，14d、21d假手術(shù)組與模型組間死亡率均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.032)，28d假手術(shù)組與模型組間死亡率存在

12、統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.006)，假手術(shù)組與治療組間死亡率存在統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.032)。⑵各時間點假手術(shù)組TBIL、DBIL、γ-GT和CREA含量明顯小于模型組與治療組(P<0.01)；OJ21、28d治療組大鼠血清TBIL、CREA含量均明顯低于模型組( P<0.050r P<0.01)；OJ28d治療組大鼠血清DBIL含量均明顯低于模型組(P<0.01)，OJ21d治療組大鼠血清γ-GT含量均明顯低于模型組(P<0.01)。⑶大體

13、、光鏡及電鏡觀察下，OJ丹參治療組大鼠的肝臟、腎臟病理改變較模型組均不同程度地減輕。⑷肝臟凋亡指數(shù)在21d丹參治療組明顯低于模型組(P<0.01)，其余各時間點各組間無顯著性差異。腎臟凋亡指數(shù)14d模型組明顯大于假手術(shù)組(P<0.01)，各時間點丹參治療組與假手術(shù)組無明顯差異(P>0.05)，14d丹參治療組明顯小于模型組(P<0.01)。⑸肝臟Bax蛋白陽性強度以及陽性強度和面積的乘積在各時間點模型組明顯大于假手術(shù)組(P<0.01)，

14、7，21，28天時間點丹參治療組明顯大于假手術(shù)組(P<0.01)，各時間點丹參治療組與模型組無顯著性差異(P>0.05)。肝臟NF-kB c-RelA蛋白陽性強度以及陽性強度和面積的乘積在7d、14d、21d模型組明顯大于假手術(shù)組(P<0.01)，各時間點丹參治療組與假手術(shù)組、模型組無顯著性差異(P>0.05)。腎臟Bax蛋白陽性強度21d模型組明顯大于假手術(shù)組(P<0.01)，各時間點丹參治療組與假手術(shù)組、模型組無明顯差異(P>0.0

15、5)。腎臟Bax蛋白陽性強度和面積乘積21d模型組明顯大于假手術(shù)組(P<0.01)，各時間點丹參治療組與假手術(shù)組無明顯差異(P>0.05)，21d丹參治療組明顯小于模型組(P<0.01)。腎臟NF-kB c-RelA蛋白陽性強度以及陽性強度和面積的乘積在各時間點假手術(shù)組與模型組、丹參治療組以及模型組與丹參治療組之間均無明顯差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：①結(jié)扎大鼠膽總管后，模型組及丹參治療組大鼠血清TBIL、DBIL及γ-G

16、T濃度均較未結(jié)扎膽總管的假手術(shù)組明顯升高，且血清膽紅素以DBIL為主；同時模型組及丹參治療組大鼠血清BUN、CREA濃度也均較假手術(shù)組明顯升高，且肝腎組織有顯著的病理損傷表現(xiàn)，說明阻塞性黃疸在肝功能受損同時也可導(dǎo)致腎功能損傷。②阻塞性黃疸大鼠可出現(xiàn)肝、腎組織Bax蛋白、肝臟NF-kB c-RelA蛋白表達(dá)明顯升高，肝、腎組織凋亡細(xì)胞指數(shù)明顯增加。③丹參能明顯地降低OJ大鼠血清TBIL、DBIL、γ-GT及CREA含量，減少肝腎細(xì)胞凋亡數(shù)