新型放射增敏劑CpG ODN107的臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤(gliomas)是世界上發(fā)病率最高的腦腫瘤，發(fā)病率為十萬(wàn)分之十二。由于腦惡性膠質(zhì)瘤浸潤(rùn)性很強(qiáng)，手術(shù)切除率很低，術(shù)后高復(fù)發(fā)，臨床上的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是采用手術(shù)切除加術(shù)后放射治療。但是，由于大多數(shù)膠質(zhì)瘤對(duì)放射線不敏感或者放射治療一段時(shí)間后對(duì)放射線的敏感性降低，即使提高照射劑量仍不能取得滿意療效。因此，研制高效的放射增敏劑，增加射線對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，對(duì)提高腦膠質(zhì)瘤的治愈率、延長(zhǎng)生存期具有重要意義。
　　 含有未甲基化CpG的

2、寡核苷酸片段(CpG oligonucleotides，CpG ODN/CpG DNA)是具有免疫激活作用的寡核苷酸，有文獻(xiàn)報(bào)道，CpG ODN可以提高肺癌、惡性腦膠質(zhì)瘤組織對(duì)化療和放療的敏感性，可增加單次放療和分次放療中射線對(duì)腫瘤的殺傷作用，具有化療和放射增敏作用。含12個(gè)堿基的硫代寡核苷酸CpG ODN107(CpGoligonucleotide107，5'-TGGCGCGGGGCG-3')是本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)早期篩選的對(duì)腫瘤有放射增敏作用

3、的CpG ODN。CpG ODN107在體內(nèi)、外的藥效學(xué)研究均表明CpG ODN107聯(lián)合射線可抑制腫瘤生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞白噬性死亡，延長(zhǎng)動(dòng)物生存時(shí)間。CpGODN107作為治療腦膠質(zhì)瘤新型放射增敏劑，合成方法簡(jiǎn)單、毒性低、質(zhì)量可靠、放射增敏效果顯著，研發(fā)成功將為腦膠質(zhì)瘤患者帶來(lái)福音，并將產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
　　 本研究項(xiàng)目是國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)“放射增敏劑候選藥物CpGODN107的研究”(2009

4、ZX09103-051)的重要研究?jī)?nèi)容之一，通過(guò)研究CpG ODN107在動(dòng)物體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄過(guò)程，闡明其在動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征，為該藥物的藥效學(xué)、毒理學(xué)研究以及臨床新藥報(bào)批提供資料，同時(shí)也為其他此類(lèi)化合物的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供方法參考和新的研究思路。
　　 主要研究?jī)?nèi)容與方法：
　　 一、生物樣品中CpG ODN107及其代謝物的檢測(cè)方法建立
　　 通過(guò)優(yōu)化和改良色譜和質(zhì)譜條件，建立高效液相色譜-

5、三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)的方法測(cè)定血漿中CpG ODN107及其代謝物(鏈縮短序列3'N-1、3'N-2、3'N-3和5'N-1)的濃度，并進(jìn)行方法學(xué)確證，包括方法的專屬性、靈敏度、定量線性范圍、日內(nèi)及日間精密度、準(zhǔn)確度、回收率、樣品穩(wěn)定性和基質(zhì)效應(yīng)的考察。在此基礎(chǔ)上，針對(duì)不同生物樣本，如尿、糞、膽汁和組織均漿液，進(jìn)行藥物提取方法的再優(yōu)化，建立不同生物樣品中CpG ODN107藥物濃度的測(cè)定方法，并進(jìn)行部分方法學(xué)確證。

6、r>　　 二、CpG ODN107及其代謝物的血漿動(dòng)力學(xué)特征
　　 描繪小鼠單次靜脈注射四個(gè)劑量(2.5、5、10和15 mg/kg)的CpG ODN107血藥濃度-時(shí)間曲線圖，以及小鼠單次靜脈注射15mg/kg CpG ODN107的代謝物的血藥濃度-時(shí)間曲線圖，采血時(shí)間點(diǎn)為給藥前和給藥后2 min、5 min、15 min、30 min、60 min、120 min、180 min、240 min、360 min、540

7、min和720 min；通過(guò)房室模型擬合和統(tǒng)計(jì)矩的方法計(jì)算CpG ODN107在四個(gè)給藥劑量以及代謝物在15mg/kg給藥劑量下的相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)；確定CpG ODN107在四個(gè)給藥劑量是否存在AUC和Cmax依賴于成正比增高的線性藥代動(dòng)力學(xué)。
　　 三、CpG ODN107的分布特征
　　 ①選擇高、中、低三個(gè)劑量濃度的藥物分別與空白小鼠、人血漿以及人血清白蛋白、等孵育，采用超過(guò)濾法，經(jīng)LC-MS/MS檢測(cè)含量，研究

8、CpG ODN107與不同種屬血漿蛋白的結(jié)合情況；②選擇5 mg/kg劑量組，小鼠尾靜脈注射給藥，在給藥后0.5h、1 h、2 h、4 h、10 h、24 h處死，解剖，提取肝、心、腦、脾、肺、腎、腸、肌肉、生殖腺等重要組織、器官藥物，LC-MS/MS藥測(cè)定物濃度，研究CpG ODN107在各組織器官中的分布特征；③腦內(nèi)注射熒光標(biāo)記的CpG ODN107，通過(guò)小動(dòng)物活體熒光成像方法研究CpG ODN107在腦中的分布特征。
　　

9、 四、CpG ODN107的排泄特征
　　 選擇5 mg/kg的給藥劑量，經(jīng)尾靜脈注射，在小鼠體內(nèi)分段收集24 h的糞、尿；選擇3.5 mg/kg的給藥劑量，經(jīng)尾靜脈注射，在大鼠體內(nèi)分段收集24 h的糞、尿和膽汁；生物樣品經(jīng)處理后LC-MS/MS測(cè)定藥物的濃度，研究CpG ODN107在尿、糞和膽汁中的排泄特征。
　　 主要研究結(jié)果：
　　 一、生物樣品中CpG ODN107及其代謝物的LC-MS/MS檢測(cè)方法建

10、立和確證
　　 優(yōu)化了CpG ODN107及其代謝物的LC-MS/MS測(cè)定條件；改進(jìn)在血漿和組織中CpG ODN107的提取方法，血漿、尿、糞、膽汁樣本經(jīng)酚仿液-液萃取結(jié)合固相萃取提取藥物，組織樣本經(jīng)DNA提取試劑盒去除內(nèi)源性核苷酸后再經(jīng)固相萃取提取藥物；以15個(gè)T堿基構(gòu)成的硫代序列為內(nèi)標(biāo)，以乙腈：0.05％氨溶液=20:80為流動(dòng)相，分析柱為Extend C18柱(150 mm×2.1 mm，3.5μm)，以高純氮?dú)庾鳛楦稍餁?/p>

11、，ESI源負(fù)離子掃描，MRM檢測(cè)方式進(jìn)行檢測(cè)。CpG ODN107在血漿中20～5000 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，在尿、膽汁中20～4000 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，在組織中0.1～40μg/g濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。3'N-1、3'N-2、3'N-3和5'N-1四種代謝物在血漿中10～2500 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。本方法專屬性強(qiáng)、線性關(guān)系良好，靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度均符合《化學(xué)藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究

12、技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，可進(jìn)行體內(nèi)藥物分析。
　　 二、CpG ODN107以及代謝物的血漿動(dòng)力學(xué)特征
　　 小鼠單次靜脈注射四個(gè)劑量(2.5、5、10和15 mg/kg)CpG ODN107后，經(jīng)DAS軟件進(jìn)行房室模型擬合，結(jié)果表明CpG ODN107在小鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過(guò)程符合靜脈注射的三室模型；統(tǒng)計(jì)矩法計(jì)算得到平均滯留時(shí)間MRT(0-t)分別為48.37、58.94、54.19和53.74min；CL分別為0.013、0

13、.012、0.013和0.005 L/min/kg；梯形法計(jì)算得到的藥時(shí)曲線下面積AUC(0-t)分別為185974.8，412136.3和732853.5 ng/mL*min。AUC0-t和Cmax的線性分析結(jié)果表明，CpG ODN107在小鼠體內(nèi)呈現(xiàn)非線性動(dòng)力學(xué)的特征。
　　 小鼠單次靜脈注射15 mg/kg CpG ODN107后，在血漿中很快檢測(cè)到3'N-1、3'N-2、3'N-3和5'N-1四種代謝物，其AUC(0-t

14、)分別為215957.9、116663.0、64572.2和105595.5ng/mL*min，MRT(0-t)分別為35.2、78.0、118.2和70.3 min。采用AUCm/AUCp表示代謝物相當(dāng)量，3'N-1、3'N-2、3'N-3和5'N-1分別為6.93％，3.75％，2.07％和3.39％，血漿中主要代謝物為3'N-1。
　　 三、CpG ODN107的分布特征
　　 ①采用超濾法分別測(cè)定了CpG ODN

15、107與人、小鼠血漿以及人血漿白蛋白(HAS)的蛋白結(jié)合率，結(jié)果表明CpG ODN107與各種屬來(lái)源的血漿蛋白結(jié)合率均較高(>96％)。CpG ODN107與HAS的結(jié)合率>90％，說(shuō)明在人血漿中主要與白蛋白結(jié)合，并且隨著藥物濃度的增加，與白蛋白的結(jié)合出現(xiàn)飽和現(xiàn)象。
　　 ②小鼠5 mg/kg尾靜脈注射CpG ODN107后，主要分布在肝、腎和脾組織。CpGODN107按在給藥0→24h的AUC排序由大到小依次為：肝>腎>脾>肌

16、肉>心>肺>睪丸>腸>腦。在腦組織中未檢測(cè)到CpG ODN107，說(shuō)明其不容易通過(guò)血腦屏障。從整個(gè)分布情況看，CpG ODN107在肝中濃度較其他組織高，分布與消除均較快；給藥后1小時(shí)，CpG ODN107在腎脾中的分布在1小時(shí)最多，可能與其在腎臟中排泄有關(guān)；CpG ODN107在心、肌肉、肺、腸和睪丸組織中分布均較低，在肺中消除最慢。
　　 ③小鼠0.25 mg/kg腦內(nèi)注射CpG ODN107后，藥物主要分布在進(jìn)針位置，4h

17、可觀察到CpG ODN107擴(kuò)散到整個(gè)腦組織，給藥48h后仍未完全消除。
　　 四、CpG ODN107的排泄特征
　　 研究結(jié)果表明，該藥是以原型藥物和縮短的寡核苷酸的形式從小、大鼠體內(nèi)排泄掉，尿排泄為主要排泄途徑。靜脈給藥24h內(nèi)，CpG ODN107在小鼠尿和糞中總共排泄的全長(zhǎng)序列的量占總給藥量的2.70％，尿和糞分別為1.79％，0.91％，以尿排泄為主；CpG ODN107在大鼠尿和糞中總共排泄的全長(zhǎng)序列的量占

18、總給藥量的0.84％，尿和糞分別為0.63％，0.21％，以尿排泄為主；大鼠膽汁中均未檢測(cè)出CpG ODN107。
　　 研究結(jié)論：
　　 1.建立了多種生物樣品中CpG ODN107和代謝物含量的LC-MS/MS的測(cè)定方法。所建方法專屬性強(qiáng)、線性關(guān)系良好、靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度均能滿足藥代動(dòng)力學(xué)研究的要求。
　　 2.CpG ODN107在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)符合三室模型，在體內(nèi)消除過(guò)程屬于非線性藥代動(dòng)力學(xué)

19、；3'N-1是血漿中主要代謝物，代謝物的在血漿中動(dòng)力學(xué)變化趨勢(shì)與原型藥物相似。
　　 3.CpG ODN107與不同種屬來(lái)源的血漿蛋白結(jié)合大于96％，主要與白蛋白結(jié)合，隨藥物濃度增加結(jié)合呈現(xiàn)飽和性；血管內(nèi)給藥后CpG ODN107主要分布在肝、腎和脾組織，分布與消除快，腦中未見(jiàn)分布；腦內(nèi)給藥后，CpG ODN107主要分布在給藥部位的腦組織，且消除慢。
　　 4.CpG ODN107在小鼠、大鼠體內(nèi)，藥物以原型藥和鏈縮短