冷保存對(duì)肝移植后肝內(nèi)膽管微循環(huán)影響及其意義的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來，隨著肝移植技術(shù)的長足進(jìn)步，肝移植已成為目前治療眾多嚴(yán)重肝病的最佳手段。但是長期以來肝移植后缺血型膽道病變(ITBL)的發(fā)生率一直居高不下，嚴(yán)重影響了肝移植病人生存率和生活質(zhì)量，業(yè)已成為阻礙肝移植療效提高的重要因素。對(duì)肝移植后ITBL的研究也已引起全球移植專家的廣泛而高度的重視。但是，肝移植后ITBL的病因至今還不甚清楚。膽管上皮細(xì)胞被認(rèn)為是肝臟冷保存及再灌注損傷的敏感靶點(diǎn)。在臨床肝移植中，經(jīng)歷較長時(shí)間冷保存的供肝在移植后雖然其肝

2、臟功能能得到良好恢復(fù)，但I(xiàn)TBL的發(fā)生率明顯增加。冷保存再灌注可引起膽管上皮壞死、脫落及纖維化，進(jìn)一步造成膽泥形成及/或膽道狹窄，這可能是肝移植術(shù)后ITBL發(fā)生的重要原因之一。 近年來，微循環(huán)及其血管內(nèi)皮細(xì)胞在冷保存再灌注損傷中的作用越來越引起研究者的重視。肝組織微循環(huán)障礙和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞受損在肝組織冷保存或缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，是引起肝組織損傷的重要原因之一。肝內(nèi)膽管組織微循環(huán)由膽管周圍血管叢構(gòu)成，充足的圍膽周血管叢血供

3、對(duì)維持膽管正常的生理結(jié)構(gòu)和功能極其重要。但是，長期以來，人們對(duì)圍膽管血管叢及其內(nèi)皮細(xì)胞在膽管冷保存再灌注損傷中的作用認(rèn)識(shí)不夠。迄今為止，國內(nèi)外均未見關(guān)于這方面研究的報(bào)道。這主要是因?yàn)獒槍?duì)圍膽管血管叢的研究非常困難。在臨床肝移植中，供肝切取時(shí)膽管循環(huán)系統(tǒng)灌洗不充分或移植術(shù)后肝動(dòng)脈血供障礙均會(huì)造成膽管組織缺血損傷和移植術(shù)后ITBL的發(fā)生。因此，我們推測圍膽管血管叢及其內(nèi)皮細(xì)胞也易受冷保存再灌注損傷，圍膽管血管叢及其內(nèi)皮細(xì)胞損傷和與此相關(guān)的膽

4、管組織微循環(huán)障礙可能在肝內(nèi)膽管冷保存再灌注損傷過程中發(fā)揮重要作用，這可能是供肝長時(shí)間冷保存易造成肝移植術(shù)后膽管組織嚴(yán)重?fù)p傷和ITBL發(fā)生的重要原因之一。 肝移植中供肝必將經(jīng)歷冷保存再灌注過程，如何預(yù)防由冷保存再灌注損傷引起的ITBL一直是肝移植研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近來的一些研究提示GSNO可能是一種最為理想的NO供體，它在體內(nèi)可以緩慢而持續(xù)地釋放NO，從而可望在缺血再灌注組織中起穩(wěn)定而持久的改善微循環(huán)和減輕組織缺血再灌注損傷的作用

5、。但是，目前已有的研究未涉及膽管組織及其微循環(huán)方面，GSNO是否能改善缺血再灌注后肝內(nèi)膽管的微循環(huán)和減輕膽管缺血再灌注損傷尚不得而知。 本課題進(jìn)行了以下三部分內(nèi)容的研究： 1、大鼠移植肝膽管冷保存再灌注損傷模型的建立和評(píng)價(jià) 2、冷保存對(duì)肝移植后肝內(nèi)膽管微循環(huán)的影響及其與肝內(nèi)膽管損傷的關(guān)系 3、GSNO對(duì)冷保存肝臟移植后肝內(nèi)膽管微循環(huán)和肝內(nèi)膽管損傷的影響 第一部分大鼠移植肝膽管冷保存再灌注損傷

6、 模型的建立和評(píng)價(jià) 材料與方法 選用體重200～250g雄性的SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，共設(shè)三個(gè)實(shí)驗(yàn)組：非重建組，采用無肝動(dòng)脈重建的“二袖套法”施行肝移植；縫合組，肝移植術(shù)中采用Engerman創(chuàng)建的血管縫合方法重建肝動(dòng)脈；支架組，肝移植術(shù)中采用Gao創(chuàng)建的置入支架的方法重建肝動(dòng)脈。各組供肝均采用4℃UW液保存24h。另設(shè)假手術(shù)組(ShamOperation,SO)作為正常對(duì)照，動(dòng)物不施行肝移植，開腹后即采集標(biāo)本，共6只大

7、鼠。各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物于術(shù)后1d、3d和7d分別留取血清和肝組織，每一時(shí)相點(diǎn)6對(duì)大鼠。另外，每組取12對(duì)大鼠觀察肝移植術(shù)后2周受體存活情況。比較各組間肝移植手術(shù)主要步驟時(shí)間、術(shù)后2周受體存活情況和膽道并發(fā)癥和肝動(dòng)脈血栓發(fā)生率。檢測血清ALT、ALP和TBIL的水平。HE染色，光鏡觀察肝組織和肝內(nèi)膽管組織損傷程度并進(jìn)行半定量評(píng)分。采用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為相差顯著。 結(jié)論 改良的Gao支架法大鼠

8、原位肝移植是理想的研究移植肝臟膽道冷保存再灌注損傷的動(dòng)物模型。 第二部分冷保存對(duì)肝移植后肝內(nèi)膽管微循環(huán)的影響及其與肝內(nèi)膽管損傷的關(guān)系 材料與方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同第一部分。采用改良Gao法建立重建肝動(dòng)脈的大鼠肝移植模型。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為三組：CP1h組，供肝4℃UW液冷保存1h；CP24h組，供肝4℃UW液冷保存24h；SO組，作為正常對(duì)照。在供肝冷保存后、術(shù)后1h、6h、1d、3d、7d留取肝組織和血清標(biāo)本，每一時(shí)相

9、點(diǎn)6對(duì)大鼠。檢測血清ALT、ALP、TBIL水平。HE染色，光鏡觀察肝內(nèi)膽管損傷程度，并行半定量評(píng)分。透射電鏡觀察匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞及微血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。經(jīng)肝動(dòng)脈注入直徑101μm的微球，肝組織冰凍病理切片，光鏡下行匯管區(qū)內(nèi)微球計(jì)數(shù)。采用間接免疫熒光雙染技術(shù)，檢測匯管區(qū)微小血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS、iNOS、ET-1和ICAM-1的表達(dá)，并行半定量評(píng)分。采用原位雜交技術(shù)檢測匯管區(qū)微小血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS、iNOS、ET-1和ICAM

10、-1的mRNA的表達(dá)，并行半定量評(píng)分。用比色法測定肝組織MPO和NO含量。采用SPSS10.0軟件包中T檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為相差顯著。 結(jié)論 1、大鼠移植肝臟肝內(nèi)膽管易受冷保存再灌損傷，隨冷保存時(shí)間的延長肝內(nèi)膽管損傷程度加重。 2、冷保存可引起大鼠移植肝臟肝內(nèi)膽管微循環(huán)及其內(nèi)皮細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)明顯改變，隨冷保存時(shí)間的延長這種改變進(jìn)一步加重。 3、冷保存再灌注引起的肝內(nèi)膽管微循

11、環(huán)變化與圍膽管血管叢內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)下調(diào)、iNOS、ET-1和ICAM-1表達(dá)上調(diào)和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)。 4、微循環(huán)障礙可能在肝內(nèi)膽管冷保存再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用。 第三部分GSN0對(duì)冷保存肝臟移植后肝內(nèi)膽管微循環(huán)和肝內(nèi)膽管損傷的影響 材料與方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和大鼠肝移植模型建立與第二部分相同。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為二組，CP24h組，與第二部分實(shí)驗(yàn)的CP24h組相同；GSNO組，應(yīng)用GSNO預(yù)處理供肝和

12、受體大鼠，其它同CP24h組。手術(shù)方法、觀察時(shí)相點(diǎn)、大鼠數(shù)量和標(biāo)本采集、觀測指標(biāo)和檢測方法同第二部分實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果 肝功能檢測結(jié)果顯示：與CP24h組比，GSNO組大鼠肝移植術(shù)后所有時(shí)相點(diǎn)的ALT和ALP水平均顯著降低(P＜0.05)，TBIL水平在術(shù)后3d和7d也顯著降低。組織病理學(xué)觀察及評(píng)分結(jié)果顯示：兩組肝內(nèi)膽管組織損傷在冷保存后無明顯差異；與CP24h組比，GSNO組肝內(nèi)膽管結(jié)構(gòu)受損、匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤和總的膽管損傷程

13、度在術(shù)后所有時(shí)相點(diǎn)均明顯減輕，膽管增生在術(shù)后3d和7d也明顯減輕(P＜0.05)。電鏡觀察結(jié)果顯示：肝移植術(shù)后，GSNO組肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)改變較CP24h組更輕。微球計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：GSNO組不同部位肝組織匯管區(qū)內(nèi)微球數(shù)量在所有時(shí)相點(diǎn)均較CP24h組顯著減少(P＜0.05)。免疫熒光雙染檢測及評(píng)分結(jié)果顯示：與CP24h組比，GSNO組匯管區(qū)微小血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)在冷保存后無明顯差異，在術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)均明顯增強(qiáng)(P＜0

14、.05)；iNOS表達(dá)在冷保存后無明顯差異，在術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)均明顯減弱(P＜0.05)；ET-1表達(dá)在各時(shí)相點(diǎn)均明顯減弱(P＜0.05)；ICAM-1表達(dá)在冷保存后和術(shù)后3d無明顯差異，其余時(shí)相點(diǎn)均明顯減弱(P＜0.05)。原位雜交檢測及評(píng)分結(jié)果顯示：它們的mRNA表達(dá)變化與免疫熒光雙染檢測顯示的它們的蛋白質(zhì)表達(dá)變化基本一致。與CP24h組比，GSNO組肝組織MPO含量在冷保存后無明顯差異，在術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)均明顯降低(P＜0.05)；GSN

15、O組肝組織NO含量在各時(shí)相點(diǎn)均明顯升高(P＜0.05)。 結(jié)論 1、GSNO治療能明顯改善大鼠移植肝冷保存再灌注后肝內(nèi)膽管組織微循環(huán)狀況。 2、GSNO對(duì)肝內(nèi)膽管組織微循環(huán)的影響與GSNO在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的NO、GSNO上調(diào)eNOS和下調(diào)ET-1、iNOS及ICAM-1的表達(dá)有關(guān)，也與GSNO減輕微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)。 3、GSNO通過改善肝內(nèi)膽管微循環(huán)間接對(duì)肝內(nèi)膽管冷保存再灌注損傷起明顯的保護(hù)作用。