丹參對肝移植大鼠供肝冷保存再灌注損傷的保護(hù)及肝細(xì)胞調(diào)亡的影響.pdf

1、供肝冷保存缺血缺氧-再灌流損傷的防護(hù)對于改善移植肝質(zhì)量，提高肝移植的成功率具有重要意義。冷保存再灌注損傷是一個(gè)由多因素參與的復(fù)雜的病理過程，其中氧自由基和炎癥介質(zhì)過度生成與釋放以及肝細(xì)胞凋亡發(fā)揮著重要作用。丹參對重要器官的缺血-再灌注損傷具有保護(hù)作用，能防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載，并具有減輕脂質(zhì)過氧化，保護(hù)細(xì)胞膜等功能。本課題建立并改進(jìn)簡便實(shí)用的雙袖套法大鼠異體原位肝移植模型，應(yīng)用含有丹參的灌注液對大鼠供肝進(jìn)行灌注和冷保存，行原位肝移植術(shù)(OLT

2、)，術(shù)后檢測缺血-再灌注損傷相關(guān)指標(biāo)變化和肝細(xì)胞凋亡及相關(guān)凋亡調(diào)控基因表達(dá)情況，研究探討丹參對移植肝臟冷保存-再灌注損傷的防護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制，為傳統(tǒng)中藥丹參應(yīng)用于肝移植中的供肝保護(hù)提供理論研究基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分：雙袖套法大鼠異體原位肝移植模型的制作與改進(jìn) 目的：探討建立并改進(jìn)簡便實(shí)用的雙袖套法大鼠異體原位肝移植模型以便在本課題研究中進(jìn)一步應(yīng)用。 方法：在Kamada及王軒方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)。供、受體均

3、為SD雄性大鼠，按照動(dòng)物大小、血管粗細(xì)選擇不同口徑醫(yī)用股動(dòng)脈穿刺管的外殼管自制成血管套管，用硬膜外麻醉導(dǎo)管制成膽管支架管，供體取腹部十字切口，顯露游離肝臟，并行供肝側(cè)膽管插管固定，以4℃林格氏液經(jīng)腹主動(dòng)脈、門靜脈低壓雙重灌注供肝，切取供肝后在相應(yīng)灌注液中低溫保存5h；行供肝修整，門靜脈及肝下下腔靜脈預(yù)置套管；受體取腹部縱切口，自制小拉鉤顯露，受體無肝期前在門靜脈分叉處兩側(cè)用縫線預(yù)置牽引線，肝上下腔靜脈采用血管膜端端“三點(diǎn)”標(biāo)記吻合法，門

4、靜脈及肝下下腔靜脈采用袖套吻合法，用自制“小針鉤”驅(qū)除氣泡并協(xié)助套管插入，膽管吻合采用單管插管吻合，不分離周圍組織，肝臟及腸管保持原位，術(shù)后經(jīng)陰莖背靜脈補(bǔ)充少量肝素生理鹽水。 結(jié)果：共行SD→SD大鼠原位肝移植手術(shù)80例，其中預(yù)備手術(shù)26例，正式實(shí)驗(yàn)54例。改進(jìn)后正式實(shí)驗(yàn)，供體手術(shù)時(shí)間平均31min，袖套準(zhǔn)備時(shí)間平均9min，受體手術(shù)時(shí)間平均48min，無肝期平均16min；1d存活率94.4％(51/54)。受體大鼠均于術(shù)后清

5、醒，可站立并爬行，術(shù)后進(jìn)食及活動(dòng)等一般狀況良好。手術(shù)各步驟較簡易快捷，成功率較高。 第二部分：丹參對大鼠移植肝冷保存再灌注損傷的保護(hù)作用 目的：應(yīng)用含有丹參的灌注液對大鼠供肝進(jìn)行灌注和冷保存，行原位肝移植術(shù)，術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)檢測受體移植肝組織中缺血-再灌注損傷相關(guān)指標(biāo)及肝功能變化，探討丹參對移植肝臟冷保存缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用與機(jī)制。 材料與方法： 1.動(dòng)物分組與模型制備 選用SD系雄性大鼠12

6、6只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組，18只)、對照組、丹參組(B組和C組，供體與受體各27對)。假手術(shù)組：只游離肝臟，不進(jìn)行肝切除和肝移植，目的是進(jìn)行正常對照，以排除手術(shù)因素對實(shí)驗(yàn)的影響。對照組及丹參組：采用上述已改進(jìn)的手術(shù)方法行SD→SD大鼠雙袖套法原位肝移植術(shù)，丹參組供肝灌洗保存液采用加丹參注射液80ml/L的林格氏液，對照組灌洗保存液不加丹參。供肝灌注切取后于4℃相應(yīng)保存液保存5h再原位植入受體。 2.標(biāo)本的采集和處理

7、對照組、丹參組受體于移植肝再灌注后1h，6h，24h各時(shí)點(diǎn)各處死8只，假組于術(shù)后同樣時(shí)點(diǎn)各處死6只取材，其余受體用于排除手術(shù)死亡及觀察存活狀態(tài)和一般狀況。從下腔靜脈采集血標(biāo)本4ml離心后取血清待測；取肝中葉，部分置-70℃冰箱保存待測，部分以2.5％戊二醛及10％多聚甲醛固定待用。 3.檢測指標(biāo) (1)血清學(xué)測定血標(biāo)本離心后取上清，采用全自動(dòng)生化分析儀測定檢丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)。 (

8、2)肝組織中MDA、SOD及TNF-α、IL-1水平檢測取各組大鼠各時(shí)點(diǎn)肝組織標(biāo)本約1g，制成勻漿后，以相應(yīng)的檢測試劑盒分別采用硫代巴比妥酸法(TBA法)、黃嘌呤氧化酶法(XOD法)測定氧自由基(OFR)代謝相關(guān)指標(biāo)丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測定肝組織炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1濃度水平。 4.統(tǒng)計(jì)分析：全部數(shù)據(jù)均由SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。多組間比較采用

9、完全隨機(jī)單因素方差分析。數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.移植肝再灌注后1h，6h及24h各時(shí)點(diǎn)，大鼠血清ALT和AST水平對照組(B組)及丹參組(C組)均較假手術(shù)組(A組)明顯升高(P<0.01)；但C組血清ALT、AST水平在移植肝再灌注后各時(shí)點(diǎn)較B組各時(shí)點(diǎn)明顯降低(P<0.05)。 2.與A組比較，B組和C組移植肝血流再灌流后肝組織MDA含量明顯升高，SO

10、D活性顯著降低(P<0.01)；但C組各時(shí)點(diǎn)肝組織MDA含量較B組減低，SOD活性較B組升高，其差異均具有顯著性(P<0.05)。 3.供肝再灌注后1h，6h及24h各時(shí)點(diǎn)，肝組織TNF-α和IL-1濃度水平，B組及C組均較A組明顯升高(P<0.01)；但C組各時(shí)點(diǎn)較B組升高程度明顯減低，其差異具有顯著性(P<0.01)。 第三部分：丹參對肝移植大鼠肝細(xì)胞調(diào)亡及其調(diào)控基因表達(dá)的影響 目的：研究丹參用于供肝灌注冷保

11、存對移植肝再灌注后肝細(xì)胞凋亡情況及凋亡調(diào)控基因Bcl-2和FasL表達(dá)的影響。同時(shí)對比觀察移植肝臟組織形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)一步探討丹參對移植肝臟冷保存缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用和機(jī)制。 材料與方法： 1.材料 低溫保存的肝組織標(biāo)本及10％多聚甲醛和2.5％戊二醛固定的標(biāo)本。 2.標(biāo)本檢測指標(biāo) (1)采用TUNEL染色法按細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作說明進(jìn)行檢測，光鏡下觀察各組大鼠肝臟各時(shí)點(diǎn)組織切片

12、肝細(xì)胞凋亡情況(凋亡細(xì)胞核呈棕咖啡色，核內(nèi)有咖啡色的凋亡小體)。細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)：每張切片高倍光鏡(×400)下隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞總數(shù)，以凋亡細(xì)胞總數(shù)/細(xì)胞總數(shù)計(jì)算出凋亡細(xì)胞百分率，作為凋亡指數(shù)(AI)。 (2)采用流式細(xì)胞儀檢測凋亡調(diào)控基因Bcl-2、FasL蛋白表達(dá)，以Bcl-2-PE標(biāo)記抗體、FasL-FITC標(biāo)記抗體加入研磨提取的移植肝組織細(xì)胞懸液進(jìn)行反應(yīng)，流式細(xì)胞儀下反應(yīng)所發(fā)熒光強(qiáng)度以對數(shù)放大，光散

13、射數(shù)據(jù)在計(jì)算機(jī)上用CellQuestPlot軟件分析計(jì)算出Bcl-2及FasL陽性表達(dá)率(％)。 (3)分別以光鏡及透射電鏡對比觀察各組大鼠肝臟標(biāo)本組織切片的病理形態(tài)學(xué)改變。 3.統(tǒng)計(jì)分析：同上。 結(jié)果： 1.假手術(shù)組(A組)大鼠各時(shí)點(diǎn)肝組織中僅見極少量TUNEL法染色的凋亡細(xì)胞。對照組(B組)及丹參組(C組)供肝再灌注后染色的凋亡細(xì)胞明顯增多，6h肝細(xì)胞凋亡染色最嚴(yán)重，亦可見少量染色陽性的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞。

14、丹參組(C組)再灌注各時(shí)點(diǎn)凋亡指數(shù)(AI)明顯低于對照組(B組)相應(yīng)時(shí)點(diǎn)AI，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 2.與假手術(shù)組(A組)比較，對照組(B組)和丹參組(C組)移植術(shù)后肝組織Bcl-2表達(dá)明顯減少，F(xiàn)asL表達(dá)明顯增加(P<0.05)，但丹參組各時(shí)點(diǎn)Bcl-2表達(dá)較對照組顯著增加(P<0.01)，F(xiàn)asL表達(dá)較對照組明顯減少，其差異具有顯著性(P<0.01)。 3.光鏡下與電鏡下假手術(shù)組肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，與

15、對照組相比，丹參組大鼠肝臟光鏡下肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂、腫脹或灶性壞死程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷減輕；電鏡下肝細(xì)胞核皺縮，染色質(zhì)濃集及線粒體腫脹有所減輕，嵴結(jié)構(gòu)不清，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張程度改善，肝組織細(xì)胞損害程度明顯減輕。 結(jié)論： 1.改進(jìn)的雙袖套法大鼠原位肝移植術(shù)可在單人直視下進(jìn)行，安全確切實(shí)用，簡化了操作，提高了手術(shù)成功率。自制血管套管簡單易行；自制小拉鉤可使暴露更加充分；經(jīng)腹主動(dòng)脈和門靜脈行供肝的雙重灌注使肝

16、臟灌注更均勻，更徹底；肝上下腔靜脈“三定點(diǎn)”縫合法吻合確切，成功率高；所有吻合均應(yīng)無張力、保持原位；自制“小針鉤”排氣效果確切迅速。肝上下腔靜脈吻合是受體手術(shù)的難點(diǎn)，減少術(shù)中出血和成功的袖套吻合是手術(shù)順利進(jìn)行的重要條件，熟練的顯微外科手術(shù)技巧及耐心細(xì)致的手術(shù)操作是模型成功的關(guān)鍵。 2.移植肝再灌注后OFR代謝相關(guān)指標(biāo)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯增加和SOD活性明顯降低，而炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1水平亦明顯升高，表明移植肝

17、冷保存再灌注損傷與OFR損傷及炎癥介質(zhì)過度釋放密切相關(guān)。用丹參灌注保存供肝可明顯減輕移植肝再灌注后肝組織中MDA的增加和SOD的下降程度，并能抑制肝組織中炎性細(xì)胞因子TNF-α及IL-1生成，從而減少OFR產(chǎn)生，減低肝組織脂質(zhì)過氧化及炎癥介質(zhì)損害，改善肝功能的損害程度，減輕供肝的冷保存再灌注損傷。 3.移植肝再灌注后肝細(xì)胞凋亡程度較正常肝組織明顯增加，抗細(xì)胞凋亡基因Bcl-2表達(dá)減少及促凋亡介導(dǎo)基因FasL蛋白表達(dá)增加，肝細(xì)胞凋