膽管周圍血管叢微循環(huán)障礙對大鼠移植肝膽管上皮細胞影響的研究.pdf

1、自1967年Thomas E.Starzl成功實施首例肝移植(Liver Transplantation，LTx)以來，歷經(jīng)近40年發(fā)展，目前LTx已成為終末期肝病最為有效的治療手段。隨著臨床LTx的發(fā)展，術后長期生存的病例不斷增多，但肝移植術后膽道并發(fā)癥的發(fā)生率仍徘徊在5.8％～24.5％，與膽道并發(fā)癥相關的病死率為6.0％～12.5％。因此處理好LTx術后膽道并發(fā)癥對提高肝移植患者的長期生存率及生活質(zhì)量具有非常重要意義。 但

2、是，直至目前，發(fā)生移植后膽管并發(fā)癥的確切病因及發(fā)病機制尚不十分清楚。可能與多種因素有關，包括缺血性膽管損害(ischemia-type biliary lesions，ITBL)、免疫性膽管損害及感染性膽管損害。目前ITBL被認為是非外科性移植物膽管樹損害的主要原因。ITBL的發(fā)病可能涉及以下幾個方面：(1)冷保存-再灌注對膽管壁組織的直接損傷；(2)膽管微血管床的損傷；(3)移植物動脈化延遲造成的膽管熱缺血損傷；(4)疏水性膽鹽對膽管

3、上皮細胞的毒性作用。 目前的研究表明，肝內(nèi)膽管的血供主要來自于肝動脈。肝內(nèi)膽管則由左右肝動脈分支形成的非軸性動脈網(wǎng)供血，在匯管區(qū)內(nèi)與門靜脈分支伴行。肝動脈的終末端與門靜脈終末端的分配靜脈同時分成更細小的微血管，并與血竇相聯(lián)。 膽管組織，尤其是膽管上皮細胞更易受冷保存一再灌注及肝動脈缺血損傷，具體原因目前尚不十分清楚。近年來，微循環(huán)及其血管內(nèi)皮細胞在冷保存-再灌注損傷中的作用越來越引起研究者的重視。已有研究表明，冷保存-再

4、灌注可引起肝、腎等組織器官的血管內(nèi)皮細胞損傷和微循環(huán)障礙，從而進一步加重組織的缺血-再灌注損傷。由此可以推測，膽管內(nèi)皮細胞及其周圍膽管血管叢在膽管冷保存-再灌注損傷以及膽管周圍血管叢的微循環(huán)缺血的病理生理過程中起著至關重要的作用。也可能是供肝長時間冷保存后易造成肝移植術后膽管組織嚴重損傷和ITBL發(fā)生的重要原因之一。 本課題將在建立大鼠肝臟原位移植模型的基礎上：①建立肝臟移植術后肝內(nèi)膽管周圍血管叢微循環(huán)障礙動物模型；②探討肝內(nèi)膽

5、管周圍血管叢微循環(huán)障礙對膽管上皮細胞的影響；③探討外源性r-VEGF<,165>對研究微循環(huán)障礙在移植肝膽管上皮細胞損傷中的作用，以及對膽管周圍血管叢微循環(huán)障礙時所致的的肝內(nèi)膽管及管周血管叢損傷是否具有保護作用，以期進一步闡明移植肝膽管上皮細胞損傷的發(fā)生機制，為臨床肝移植術后ITBL的防治提供理論參考。方法與結(jié)果：1、實驗動物SD大鼠采用改良Gao's大鼠肝臟移植手術方式重建肝動脈。在此肝臟移植實驗的基礎上，將各組實驗動物按照給予不同干

6、預因素再隨機分為三個實驗組，于首次手術后3天行二次手術：A組：肝動脈結(jié)扎(HAL)組。包括A1：UW液保存2h；A2：8h；A3：16h；B組：肝動脈微球注射+肝動脈結(jié)扎(MS+HAL)組，C組：對照(S0)組，同樣分亞組。設術后3d、7d兩個時相點，每一時相點6對大鼠。選取P8組進行了組織病理學觀察及評分：移植術后HAL組膽管損傷、肝小葉壞死、較SO組嚴重，而MS+HAL組則更加嚴重，統(tǒng)計學比較有顯著性差異(P<0.05)。

7、2．對第一部分實驗標本行免疫組化檢測，結(jié)果表明PCNA、CK-19、F-Ⅷ-Ag、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFR-2、VEGFR-3均有蛋白表達，其中2h表達最強，16h表達最弱，8h介于二者之間，并且7d均高于3d。同組內(nèi)不同時間段或同一時間段不同亞組間比較，僅少數(shù)無顯著性差異。 VEGFR-1則無蛋白表達。選取P2h亞組作RT-PCR顯示，各亞組均有VEGF及其受體的mRNA表達，相對密度比值顯示同組內(nèi)不同時間段或同

8、一時間段不同亞組間比較，僅少數(shù)無顯著性差異。并且7d均高于3d。 3．在第一部分的二次手術基礎上，選取P8h組，在給予不同干預措施的同時給予r-VEGF<,165> 2ml(2.5ng/ml)腹腔注射，每日2次，同樣取術后3d、7d時間段，每時段每組6只動物。組織病理學觀察及評分：移植術后各實驗組組膽管損傷、肝小葉壞死、較對照組組減輕，統(tǒng)計學比較有顯著性差異(P<0.05)。免疫組化檢測PCNA、CK-19、F-Ⅷ-Ag、VEG

9、FA、VEGFB、VEGFC、VEGFR-2、VEGFR-3均有蛋白表達，其中實驗組P8HALV組表達最強，對照組P8MSHAL組表達最弱，其余各組介于二者之間，并且7d均高于3d。同組內(nèi)不同時間段或同一時間段不同亞組間比較，僅少數(shù)無顯著性差異。VEGFR-1仍無蛋白表達。RT-PCR顯示，各亞組均有VEGF及其受體的mRNA表達，相對密度比值顯示同組內(nèi)不同時間段或同一時間段不同亞組間比較，僅少數(shù)無顯著性差異。并且7d均高于3d。

10、 結(jié)論： 1．成功建立的大鼠肝臟移植術后膽管周圍血管叢微循環(huán)障礙動物模型，是研究肝臟移植術后膽管周圍血管叢微循環(huán)缺血對膽管上皮細胞的影響的較理想模型； 2．大鼠肝臟移植術后膽管周圍血管叢微循環(huán)缺血可刺激膽管上皮細胞過度表達VEGFA、VEGFB、VEGFC及其受體VEGFR-2、VEGFR-3蛋白；其可以改善膽管周圍血管叢微循環(huán)缺血，并誘導膽管周圍血管叢的增生，進而促進膽管上皮細胞的修復； 3．外源性r-VEG