慢性胰腺炎與胰島β細(xì)胞K-,ATP-通道相關(guān)性研究.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分 慢性胰腺炎大鼠模型的建立 目的：建立油酸誘導(dǎo)的慢性胰腺炎大鼠模型，證實(shí)模型成功，為進(jìn)一步對胰島β細(xì)胞 K<,ATP>通道的功能改變和藥物影響作用、以及防治胰源性糖尿病的研究奠定基礎(chǔ)。 方法：選取健康Wistar大鼠，隨機(jī)分為造模組和對照組。造模組行胰膽管插管后，用油酸經(jīng)插管向胰腺內(nèi)逆行灌注的方法制作慢性胰腺炎大鼠模型，對照大鼠經(jīng)插管灌注等量的生理鹽水。觀察大鼠術(shù)后6周的胰腺形態(tài)、病理

2、改變，以及口服糖耐量、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和血胰島素的變化。 結(jié)果：造模組大鼠術(shù)后6周表現(xiàn)糖耐量異常，F(xiàn)BG明顯升高(p<0.05)，血胰島素含量明顯降低(p<0.05)。胰腺病理顯示：胰腺導(dǎo)管和腺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞，部分區(qū)域明顯壞死，血管擴(kuò)張充血；炎細(xì)胞浸潤明顯，以淋巴細(xì)胞為主，炎細(xì)胞周圍可見空暈；胰島結(jié)構(gòu)破壞，α、β細(xì)胞不同程度的減少。部分組織可見纖維組織增生。 結(jié)論：油酸誘導(dǎo)的

3、慢性胰腺炎大鼠模型表現(xiàn)為外分泌腺體廣泛退化，內(nèi)分泌腺體損傷，并出現(xiàn)糖耐量異常、空腹血糖和血清胰島素含量異常，模型制作成功，可用于進(jìn)一步作慢性胰腺炎與胰島β細(xì)胞K<,ATP>通道相關(guān)性的研究。 第二部分 慢性胰腺炎胰島β細(xì)胞KATP通道的表達(dá)及藥物的干預(yù)作用 目的：觀察慢性胰腺炎大鼠胰島β細(xì)胞K<,ATP>通道表達(dá)的改變，探討西藥那格列奈和中藥丹參素對胰島β細(xì)胞K<,ATP>通道表達(dá)的干預(yù)作用，及藥物對CP大鼠糖耐量、空腹

4、血糖、胰導(dǎo)素水平等異常改變的治療作用和作用機(jī)制。 方法：選取健康Wistar大鼠，參照第一部分方法建立慢性胰腺炎大鼠模型和對照，成模后將大鼠分為模型組、那格列奈組、丹參素組和對照組，每組10只，那格列奈組大鼠每日每只予那格列奈溶液(37.5mg/kg 體重)灌胃，丹參素組大鼠每日每只予丹參素溶液(0.224mg/kg 體重)灌胃，模型組與對照組大鼠均每日以蒸餾水(0.5ml/100g 體重)灌胃，共4周。4周后測定口服糖耐量(O

5、GTT)、空腹血糖(FBG)和血胰島素的變化，處死動(dòng)物留取胰腺組織及血標(biāo)本，觀察各組大鼠胰腺形態(tài)、病理改變，激光共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光染色的胰島β細(xì)胞K<,ATP>通道亞基 Kir6.2和SUR1 的表達(dá)改變，Westem blot法檢測Kir6.2和SURl蛋白表達(dá)改變，RT—(巢式)—PCR法檢測 Kir6.2和SUR1的mRNA表達(dá)改變，以及兩種藥物的干預(yù)作用。 結(jié)果：模型組大鼠與對照組相比，表現(xiàn)為糖耐量異常，F(xiàn)BG 明

6、顯升高(p<0.05)，血胰島素含量明顯降低(p<0.05)；那格列奈和丹參素可以有效的改善這些異常(p<0.05)，那格列奈治療效果更為明顯。胰腺病理顯示：模型組胰腺導(dǎo)管和腺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞，部分區(qū)域明顯壞死，血管擴(kuò)張充血：炎細(xì)胞浸潤明顯，以淋巴細(xì)胞為主，炎細(xì)胞周圍可見空暈；胰島結(jié)構(gòu)破壞，α、β細(xì)胞不同程度的減少。部分組織可見纖維組織增生。那格列奈治療組可見破壞的胰島結(jié)構(gòu)部分修復(fù)，α、β細(xì)胞數(shù)量比模型組增多，丹參素治療組則可見到炎細(xì)胞浸

7、潤數(shù)量明顯減少，胰腺纖維化表現(xiàn)減輕。Westem blot 顯示模型組 Kir6.2和 SUR1 蛋白表達(dá)顯著低于對照組(p<0.05)，那格列奈對于二者的表達(dá)表現(xiàn)了一定的上調(diào)作用，丹參素對于β細(xì)胞K<,ATP>通道的表達(dá)幾乎沒有影響，這與免疫熒光觀察到的結(jié)果基本一致。RT—(巢式)—PCR檢測Kir6.2和SUR1 mRNA結(jié)果顯示，模型組二者mRNA表達(dá)明顯低于對照組(p<0.05)，那格列奈對二者mRNA表達(dá)較模型組有上調(diào)作用，但

8、仍顯著低于對照組，丹參素對兩種亞基mRNA表達(dá)的改善幾乎沒有作用。 結(jié)論：油酸誘導(dǎo)的慢性胰腺炎大鼠表現(xiàn)出糖耐量異常、空腹血糖和血清胰島素含量異常，外分泌腺體廣泛退化，內(nèi)分泌腺體損傷，慢性炎癥浸潤及組織纖維化，胰島β細(xì)胞K<,ATP>通道蛋白及mRNA表達(dá)降低，那格列奈和丹參素能從不同程度、不同角度對這些異常有所改善。中西醫(yī)結(jié)合治療將具有較好的療效和應(yīng)用前景。 第三部分 大鼠胰島細(xì)胞的分離、純化和原代培養(yǎng)的方法研究

9、 目的：研究正常Wistar大鼠胰島細(xì)胞分離、純化和原代培養(yǎng)的最優(yōu)方法和條件，提供胞膜完整、活性佳的胰島細(xì)胞，為進(jìn)一步探討慢性胰腺炎大鼠胰島細(xì)胞電生理改變及藥物的干預(yù)作用提供必要的前提和基礎(chǔ)。 方法：水合氯醛腹腔麻醉，采用膠原酶v逆行灌注、原位消化及Ficoll-400梯度離心的方法分離、純化大鼠胰島，并分離、培養(yǎng)胰島單細(xì)胞。 結(jié)果： 1.采用膠原酶逆行灌注、Ficoll-400梯度離心法分離、純化胰島，每只大鼠