靶向干擾Sertoli細(xì)胞功能的避孕蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及活性的研究.pdf

1、每個睪丸支持細(xì)胞(Sertoli細(xì)胞)與30～50個生殖細(xì)胞相聯(lián)系，Sertoli細(xì)胞與生精細(xì)胞共同構(gòu)成睪丸的精曲小管，Sertoli細(xì)胞不僅在結(jié)構(gòu)上為生精細(xì)胞的分化成熟提供支架，供給生精過程所需的能量及營養(yǎng)物質(zhì)；同時可分泌如轉(zhuǎn)運蛋白類、調(diào)節(jié)蛋白類、生長因子類、類固醇類等數(shù)十種物質(zhì)參與生精細(xì)胞的分化成熟，具有精細(xì)的協(xié)調(diào)作用，保證精子發(fā)生的正常有序進(jìn)行。Sertoli細(xì)胞之間接近基底水平的緊密連接是血睪屏障主要結(jié)構(gòu)成分，在精子發(fā)生過程中，

2、細(xì)線前期和細(xì)線期精母細(xì)胞必須不斷從曲細(xì)精管上皮的基底部穿越血睪屏障向腺腔部分遷移，并分化為單倍體精細(xì)胞，生殖細(xì)胞的遷移過程包含了細(xì)胞間緊密連接(TJs)和黏附連接(AJs)精細(xì)的動力學(xué)變化：時相性“關(guān)閉”和“開放”。如果能干擾Sertoli細(xì)胞間的連接，勢必使正常的精子排放受到影響。這可能成為男性避孕措施的有效途徑。 閉鎖因子是組成緊密連接的關(guān)鍵膜蛋白，該蛋白由4個跨膜結(jié)構(gòu)域，2個胞外環(huán)，1個胞內(nèi)環(huán)，1個小NH2-末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域

3、，1個大的COOH-末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。其第1個胞外環(huán)發(fā)揮細(xì)胞黏附作用，其第2個胞外環(huán)可干擾上皮細(xì)胞株中緊密連接屏障的裝配。它的任何改變均可破壞TJs，從而破壞AJs，而TJs在精子的成熟和釋放中起著關(guān)鍵性的作用。細(xì)胞間的TJs廣泛存在于各類組織細(xì)胞中，如果非靶向地干擾閉鎖因子功能，可能導(dǎo)致機(jī)體其它組織細(xì)胞間TJs屏障的非特異性功能損害，出現(xiàn)嚴(yán)重副作用。為此，將對應(yīng)閉鎖因子的多肽與靶向作用于Sertoli細(xì)胞的特異性分子耦合，通過特異性

4、靶向干擾睪丸內(nèi)Sertoli細(xì)胞間TJs蛋白的功能狀態(tài)，才能特異性抑制或干擾精子發(fā)生和排放過程，達(dá)到可逆性避孕目的。卵泡刺激素(FSH)是女性卵泡成熟和男性精子發(fā)生必須的糖蛋白。在男性，F(xiàn)SH受體僅存在于Sertoli細(xì)胞胞膜上，F(xiàn)SH由α、β兩個亞單位組成，其中α-亞單位與LH、HCG等激素具有共同序列，而β-亞單位具有種屬和激素特異性。 本研究選擇僅有受體結(jié)合活性，但無激素生物活性的FSH-β亞單位中的部分序列，與編碼閉鎖因

5、子中第二個胞外環(huán)發(fā)揮緊密連接功能的相應(yīng)基因序列進(jìn)行基因重組，通過畢赤酵母真核表達(dá)獲得融合蛋白，以期獲得可靶向干擾Sertoli細(xì)胞功能，從而干擾精子生成達(dá)到避孕的目的。 本研究內(nèi)容主要分三個部分：①pPIC9KFSH-Occludin酵母表達(dá)載體的構(gòu)建。利用RT-PCR技術(shù)，從小鼠新鮮腦組織中提取總RNA擴(kuò)增獲得FSH-β亞單位，同法從小鼠新鮮睪丸組織中提取總RNA擴(kuò)增occludin。通過部分重疊：PCR擴(kuò)增，獲得含F(xiàn)SH-β

6、亞單位特定基因序列和閉鎖因子第2個胞外環(huán)序列的耦合片段，NotI+EcoRI雙酶切pPIC9K質(zhì)粒及目的片段后分別鋪膠回收，連接過夜。所構(gòu)建載體均轉(zhuǎn)化大腸桿菌，快速抽提陽性質(zhì)粒DNA，酶切及測序鑒定。②FSH-Occludin蛋白在畢赤酵母中表達(dá)、純化及活性初步鑒定。構(gòu)建載體以電穿孔法轉(zhuǎn)染酵母菌GS115，依次進(jìn)行G418篩選，PCR篩選鑒定、Mut篩選及小量搖瓶培養(yǎng)實驗，尋找高拷貝菌株與表達(dá)蛋白的最佳收獲時段，篩選結(jié)束后大量搖菌，于最

7、佳時段收獲上清液，經(jīng)超濾濃縮、分子篩純化后將所收集樣品冷凍抽干備用。純化后蛋白用SDS-PAGE、Western-Blot鑒定，并用免疫組化法檢測其生理活性。③FSH-occludin融合蛋白避孕效應(yīng)的研究。本研究將FSH-occludin融合蛋白皮下注射Balb/c小鼠，取各時期動物血清，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測性激素睪酮和FSH的濃度并監(jiān)測血清抗體滴度的變化，并用光鏡和電鏡觀察了融合蛋白所導(dǎo)致睪丸組織的免疫性病理變化，動物免疫結(jié)束后合籠檢

8、測其免疫性避孕效應(yīng)與可逆性。 研究的主要實驗方法及結(jié)果如下： 1.通過生物信息學(xué)分析設(shè)計合成引物，采用RT-PCR技術(shù)分別從小鼠腦組織和睪丸組織成功擴(kuò)增出FSH和Occludin的cDNA序列，PCR擴(kuò)增出FSH-β亞單位33-100aa(68aa)及Occludin207-228aa(22aa)和197aa-241aa(45aa)區(qū)域的3個目的片段，通過部分重疊雙重PCR法獲得閉鎖因子第二個胞外環(huán)序列和FSH-β亞單位

9、基因序列的耦合片段，酶切連接后構(gòu)建了2種載體(Ppic9k-6822與Ppic9k-6845)，本研究將編碼FSH-β亞單位上36及39位氨基酸上的TGT(半胱氨酸)突變成TCT(絲氨酸)使其與受體的結(jié)合不受影響，但減少了其生物激動劑的活性。經(jīng)測序證實完全符合預(yù)想設(shè)計。 2.將表達(dá)載體采用單交換的整合方式電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115，篩選高拷貝重組轉(zhuǎn)化子，經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot分析證實獲得了重組蛋白，完成了F

10、SH-Occludin融合蛋白的酵母表達(dá)、純化及免疫組化生物活性鑒定。 3.將融合蛋白免疫：Balb/c雄鼠，對照組注射PBS。免疫后實驗組出現(xiàn)特異性IgG抗體，血清中促卵泡生成激素激素(FSH)及睪酮(T)水平各組無明顯差異。實驗組小鼠睪丸曲細(xì)精管管腔內(nèi)的精子數(shù)以及附睪尾部精子數(shù)相對PBS組明顯減少，電鏡下觀察到免疫組支持細(xì)胞與生精細(xì)胞的緊密連接被打開，失去依托關(guān)系，生精細(xì)胞之間有較大間隙。結(jié)果證實重組蛋白可靶向性干擾Sert

11、oli細(xì)胞的TJs，實驗組受孕率、產(chǎn)仔率明顯低于對照組且其避孕效應(yīng)具有可逆性。重組蛋白具有良好的靶向性，90d后免疫組的受孕率及產(chǎn)仔數(shù)均有不同程度的恢復(fù)符合可逆性避孕的研究設(shè)想。 由此實驗結(jié)果可以得出Occludin的第2個胞外環(huán)確是可以干擾細(xì)胞之間的TJs，而且第2個胞外環(huán)中的外部區(qū)域在緊密連接中有著非常重要的作用。融合蛋白能靶向干擾Sertolicell的TJs從而干擾精子生成且其避孕效應(yīng)具有可逆性。本研究的實施為開辟一種安