可溶性環(huán)氧化合物水解酶抑制劑對內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響.pdf

1、第一部分小鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：研究小鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法并對其進(jìn)行鑒定。
　　 方法：
　　 1.小鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng):用密度梯度離心法從小鼠股骨及脛骨骨髓中分離單個(gè)核細(xì)胞，按5×105/cm2密度置于包被有人纖維連接蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入含5％FBS和生長因子的EBM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)。顯微鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)種植的內(nèi)皮祖細(xì)胞形態(tài)變化。
　　 2.培養(yǎng)的內(nèi)

2、皮祖細(xì)胞雙熒光染色:熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞攝取Dil-AcLDL及結(jié)合FITC-UEA-1特性，染色雙陽性細(xì)胞為EPCs。
　　 3.小鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)的鑒定:培養(yǎng)七天后用流式細(xì)胞儀檢測CD34、 CD133、CD31、 Flk-1等內(nèi)皮祖細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.分離單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)4天后，顯微鏡下可見集落形成，集落中央為圓形細(xì)胞，周圍為梭形細(xì)胞圍繞；;天后見培養(yǎng)的細(xì)胞集落明顯擴(kuò)大，集落

3、中央圓形細(xì)胞向梭形細(xì)胞轉(zhuǎn)化；第;天可見培養(yǎng)細(xì)胞形成條索狀；第;0天培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞可達(dá)80％-90％融合，以類圓形和多角形細(xì)胞為主，也可見梭形細(xì)胞。
　　 2.顯微鏡下計(jì)數(shù)Dil-AcLDL及結(jié)合FITC-UEA-1染色雙陽性細(xì)胞為95％以上。
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果示細(xì)胞表面特異性抗原含量分別為CD34(53.89+0.34)％; CD133(52.79±0.67)％; CD31(36.67±0.93)％;Flk

4、-1(43.88±0.48)％。
　　 結(jié)論：通過形態(tài)學(xué)、（DiI-ac-LDL/FITC-UEA-1）熒光雙染色和流式細(xì)胞檢測證明培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　 第二部分可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑t-AUCB體外對小鼠EPCs功能的影響及機(jī)制
　　 目的：檢測不同濃度可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑t-AUCB(trans-4-[4-(3-adamantan-1-ylureido-cyclohexyloxy]-ben

5、zoic acid)）及PPARγ(peroxisome proliferator activated receptorγ)受體阻滯劑(GW9662)干預(yù)后對內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、粘附、遷移、歸巢、血管生成、分泌VEGF(vascular endothelial growth factor)及HIF1-α(hypoxiainducible factor1 alph)的影響及機(jī)制。
　　 方法：內(nèi)皮祖細(xì)胞接種7天后用不同濃度(0、1、1

6、0、50、100μmol/Lt-AUCB、GW9662+100μmol/L t-AUCB)干預(yù)細(xì)胞，后取相同數(shù)量1×105個(gè)細(xì)胞分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):
　　 1.將細(xì)胞消化至96孔板，按不同濃度t-AUCB干預(yù)24小時(shí)后孔內(nèi)加MTT，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，計(jì)算其對增殖的影響。
　　 2.細(xì)胞接種于纖連蛋白包被的12孔培養(yǎng)板，37℃孵育1h，除去未貼壁細(xì)胞，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)粘附細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其對粘附的影響。

7、　　 3.細(xì)胞添加至transwell板的上層，下層添加含有不同濃度t-AUCB的遷移緩沖液，37℃孵育4h后，測定遷移至下層的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算t-AUCB對遷移的影響。
　　 4.細(xì)胞與2μg/mL Dil-ac-LDL共同培養(yǎng)1h，心肌梗死手術(shù)后立即給小鼠尾靜脈注射，術(shù)后24h，心臟切小粒，循序在酶中消化，用胎牛血清中和，離心后在熒光顯微鏡下記數(shù)Dil標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算t-AUCB對內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢的影響。
　　 5

8、.細(xì)胞接種于預(yù)先孵育的Matrigel板上，加入不同濃度t-AUCB孵育24h后倒置顯微鏡下觀察血管生成情況。
　　 6.細(xì)胞進(jìn)行消化、提取蛋白，經(jīng)western blot檢測其分泌VEGF及HIF1-α能力。
　　 結(jié)果：
　　 1.從0μmol/L-100μmol/L，隨著濃度增加，t-AUCB可呈濃度依賴性增強(qiáng)EPCs的增殖能力，與對照組(0μmol/L)相比，1，10，50，100μmol/Lt-AUCB

9、顯著增強(qiáng)EPCs增殖能力(P＜0.05); PPARγ受體阻滯劑(GW9662)可抑制其上述功能(P＜0.05)。
　　 2.從0μmol/L-100μmol/L，隨著濃度增加，t-AUCB可呈濃度依賴性增強(qiáng)EPCs的粘附能力，與對照組(0μmol/L)相比，1，10，50，100μmol/Lt-AUCB顯著增強(qiáng)EPCs粘附能力(P＜0.05); PPARγ受體阻滯劑(GW9662)可抑制其上述功能(P＜0.05)。
　　

10、 3.從0μmol/L-100μmol/L，隨著濃度增加，t-AUCB可呈濃度依賴性增強(qiáng)EPCs的遷移能力，與對照組(0μmol/L)相比，1，10，50，100μmol/Lt-AUCB顯著增強(qiáng)EPCs遷移能力(P＜0.05); PPARγ受體阻滯劑(GW9662)可抑制其上述功能(P＜0.05)。
　　 4.從0μmol/L-100μmol/L，隨著濃度增加，t-AUCB可呈濃度依賴性增強(qiáng)EPCs的歸巢能力，與對照組(0μm

11、ol/L)相比，1，10，50，100μmol/Lt-AUCB顯著增強(qiáng)EPCs歸巢能力(P＜0.05); PPARγ受體阻滯劑(GW9662)可抑制其上述功能(P＜0.05)。
　　 5.從0μmol/L-100μmol/L，隨著濃度增加，t-AUCB可呈濃度依賴性增強(qiáng)EPCs的血管生成能力，與對照組(0μmol/L)相比，1，10，50，100μmol/Lt-AUCB顯著增強(qiáng)EPCs血管生成能力(P＜0.05); PPARγ受

12、體阻滯劑(GW9662)可抑制其上述功能(P＜0.05)。
　　 6.從0μmol/L-100μmol/L，隨著濃度增加，t-AUCB可呈濃度依賴性增強(qiáng)EPCs合成VEGF及HIF1-α能力，與對照組(0μmol/L)相比，1，10，50，100μmol/Lt-AUCB顯著增強(qiáng)EPCs合成VEGF及HIF1-α能力(P＜0.05); PPARγ受體阻滯劑(GW9662)可抑制其上述功能(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：從0

13、μmol/L-100μmol/L，隨著濃度增加，t-AUCB可呈濃度依賴性增強(qiáng)EPCs的EPCs增殖、粘附、遷移、歸巢、血管生成及分泌VEGF及HIF-α能力，該作用可能通過PPARγ受體發(fā)揮作用。
　　 第三部分 t-AUCB處理后的EPCs體內(nèi)注射對小鼠缺血心肌的影響及機(jī)制
　　 目的：研究不同濃度t-AUCB及PPARγ受體阻滯劑(GW9662)處理后的EPCs體內(nèi)注射對小鼠心肌梗死的影響及機(jī)制
　　 方法

14、：
　　 1.通過結(jié)扎小鼠左前降支制作心肌梗死模型，并記錄梗死心電圖。
　　 2.梗死后1小時(shí)分別通過尾靜脈注射200μl不同濃度(0、1、10、50、100μmol/L、100μmol/L t-AUCB+GW9662)干預(yù)的小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　 3.在心肌梗死后24小時(shí)、3天、7天、14天、28天處死小鼠，取出心臟，行福爾馬林固定，測定梗死心肌面積占結(jié)扎點(diǎn)橫切面以下心臟面積百分比。
　　 4.通過免疫

15、組化檢測VEGF及Ⅷ(factorⅧ)測定梗死心肌邊緣區(qū)血管生成數(shù)。
　　 5.對相同時(shí)間點(diǎn)不同濃度干預(yù)組梗死心肌面積比及血管生成數(shù)量進(jìn)行比較。
　　 6.對相同濃度組干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)梗死心肌面積比及血管生成數(shù)量進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：
　　 1.制作心肌梗死模型時(shí)，結(jié)扎瞬間可見結(jié)扎線遠(yuǎn)端心肌活動度減弱，左室前壁蒼白后紫紺，行心電圖檢查表現(xiàn)為前壁導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高，表明模型制作成功。
　　 2

16、.相同時(shí)間點(diǎn)不同濃度移植組心梗面積百分比示:心梗移植后24小時(shí)不同濃度干預(yù)組間面積比無顯著差異(P=0.481);移植后3天、7天、14天、28天，隨著濃度增加，各干預(yù)組面積比逐漸減小，100μmol/L t-AUCB+GW9662組面積比明顯大于100μmol/L組，不同濃度t-AUCB各干預(yù)組間存在顯著差異(P＜0.05)。
　　 3.相同濃度t-AUCB干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)心梗面積百分比示:
　　 (1)0μmol/L

17、組示:從24小時(shí)至14d，隨著時(shí)間延長，心梗面積比逐漸增大;從14d至28d，面積比逐漸縮小，各時(shí)間點(diǎn)間具有顯著差異(P＜0.05)。
　　 (2)1μmol/L組示:從24h至3d，面積比較前逐漸縮小;3天至14天，面積比較前逐漸增大;14天至28天，面積比較前逐漸縮小，各時(shí)間點(diǎn)間具有顯著差異(P＜0.05)。
　　 (3)10、50、100μmol/L組示:從24小時(shí)至7天，面積比逐漸縮小;7天至14天，面積比較前逐

18、漸增大，但仍小于24小時(shí)面積比;從14天至28天，面積比較前逐漸縮小，各時(shí)間點(diǎn)間具有顯著差異(P＜0.05)。
　　 (4)100μmol/L t-AUCB+gw9662組示:從24小時(shí)至3天，面積比逐漸增大;3天至7天，面積比較前逐漸減小;7天至14天，面積比較前增大;從14天至28天，心梗面積比較前明顯縮小。各時(shí)間點(diǎn)間具有顯著差異(P＜0.05)。
　　 4.相同時(shí)間點(diǎn)不同濃度干預(yù)組血管數(shù)結(jié)果示:隨著濃度增加，各干預(yù)

19、組血管生成數(shù)明顯增多，100μmol/L t-AUCB+gw9662組結(jié)果明顯低于100μmol/L組。各組間均具有顯著差異(P＜0.05)。
　　 5.相同濃度t-AUCB干預(yù)組不同時(shí)間點(diǎn)血管數(shù)比較示:隨著干預(yù)后時(shí)間延長，各干預(yù)組血管生成數(shù)明顯增多，100μmol/Lt-AUCB+gw9662組結(jié)果明顯低于100μmol/L組。各組間均具有顯著差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：sEH抑制劑t-AUCB參與正向調(diào)控EP