姜黃素對內(nèi)皮祖細(xì)胞功能及內(nèi)皮型一氧化氮合酶的影響.pdf

1、目的：觀察姜黃素對體外培養(yǎng)的人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)功能及內(nèi)皮型一氧化氮合酶的影響。探索體外擴(kuò)增內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的藥物方法。 方法：采用密度梯度離心法分離人外周血單個核細(xì)胞(MNCs)。將所得MNCs接種到事先包被纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶里，加入5ml含10％胎牛血清的M199培養(yǎng)液。培養(yǎng)3天后，PBS液洗去未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換全液，培養(yǎng)第6天的細(xì)胞用于實驗。采用標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?D

2、iI-ac-LDL)攝取試驗和荊豆凝集素(FITC-UEA-1)結(jié)合實驗，以及CD34、flk-1和Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色體外血管形成試驗對內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 收集內(nèi)皮祖細(xì)胞并分成4組，分別加入姜黃素(0、5、10、15μmol/L)培養(yǎng)一定時間(6、12、24和48h)。分別采用流式細(xì)胞儀檢測其數(shù)量，CCK-8法檢測增殖能力，培養(yǎng)計數(shù)法檢測粘附能力，改良的Boyden小室檢測遷移能力，采用體外血管形成試劑盒檢測EPCs血

3、管生成能力，Griess法檢測NO分泌量及RT-PCR測定eNOS基因表達(dá)。所得數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示，組間比較采用T檢驗，單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05為有顯著差異。 結(jié)果： 1.EPCs培養(yǎng)及鑒定 密度梯度離心法分離得到人外周血單個核細(xì)胞，培養(yǎng)3天洗去未貼壁的細(xì)胞，可以見到典型的細(xì)胞集落以及圓形或不規(guī)則形狀的貼壁細(xì)胞。典型的集落形態(tài)為：中間為大量的圓形細(xì)胞，層層疊疊，外周為梭形細(xì)胞，

4、向外放射狀擴(kuò)散。培養(yǎng)3-7天，絕大多數(shù)細(xì)胞逐漸分化為梭形細(xì)胞，出現(xiàn)條索樣或軌道樣結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)7天左右細(xì)胞生長至融合狀態(tài)給予傳代處理，20天左右細(xì)胞形成典型的鋪路石樣排列，表現(xiàn)為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)特點。 流式細(xì)胞術(shù)鑒定：人外周血單個核細(xì)胞培養(yǎng)6天后流式細(xì)胞術(shù)分析示CD34陽性細(xì)胞比例為(73.13±8.51)％，VE-Cadherin陽性細(xì)胞比例為(62.65±10.90)％，KDR(VEGFR-2)陽性細(xì)胞比例為(7.16±1.3

5、1)％，CD133陽性細(xì)胞比例為(5.15±2.15)％，CD34、VE-Cadherin雙陽性細(xì)胞比例為(60.17±9.47)％，KDR、VE-Cadherin雙陽性細(xì)胞比例為(5.71±0.74)％，CD34、CD133雙陽性細(xì)胞比例為(3.87±0.40)％，KDR(VEGFR-2)、CD133雙陽性細(xì)胞比例為(4.49±0.55)％。 EPCs雙染色實驗：通過熒光倒置顯微鏡鑒定，吞噬DiI-ac-LDL的細(xì)胞激發(fā)紅色熒

6、光，結(jié)合FITC-UEA-Ilectin的細(xì)胞激發(fā)綠色熒光，為正在分化的EPCs?？瞻讓φ战MEPCs不顯色。 培養(yǎng)兩周后細(xì)胞Ⅶ因子相關(guān)抗原免疫組化陽性，胞漿呈棕黃色，一抗以PBS替代的空白對照不顯色，作為對照的胃癌細(xì)胞也不顯色。 2、不同濃度姜黃素對體外培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及功能的影響 姜黃素與內(nèi)皮祖細(xì)胞體外共培養(yǎng)24小時后實驗顯示：與對照組相比，姜黃素(5、10、15μmol/L)增加外周血EPCs的數(shù)量，分別

7、為(50±9)、(60±11)、(85±13)、(125±10)，組間相比有顯著差異(P＜0.01)；改善EPCs的體外增殖能力，分別為(0.841±0.247)、(0.905±0.050)、(0.933±0.119)、(0.950±0.010)，組間相比有顯著差異(P＜0.05)；改善其粘附能力，分別為(30.3±0.5)、(33.6±1.70)、(34.0±2.7)、(36.3±3.50)，組間相比有顯著差異(P＜0.05)；改善其

8、遷移能力，分別為(12.3±0.5)、(13.8±1.5)、(15.8±2.6)、(19.5±3.3)，組間相比有顯著差異(P＜0.01)；促進(jìn)其體外血管生成能力，分別為(22.2±5.1)、(31.2±2.5)、(40.3±6.5)、(45.1±3.0)，組間相比有顯著差異(P＜0.01)；姜黃素呈時間依賴性促進(jìn)EPCs來源的NO的釋放(P＜0.01)；并上調(diào)eNOS基因表達(dá)，與對照組mRNA相比，不同姜黃素組比值分別為(150±5)