IGFBP-2及IGFBP-3對(duì)卵巢上皮性癌患者體內(nèi)IGF-Ⅱ的生物學(xué)功能調(diào)節(jié)及體外化療耐藥相關(guān)研究.pdf

1、目的：卵巢上皮性癌（EOC，以下簡(jiǎn)稱為卵巢癌）是導(dǎo)致婦女癌性死亡的主要原因。其特點(diǎn)為缺乏早期癥狀、就診晚及生存率低。經(jīng)腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及以鉑類為主的化療可產(chǎn)生初始療效，但70％的晚期患者可因化療耐藥而導(dǎo)致治療失敗。尋求新的診斷和預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)，并探討化療耐藥相關(guān)機(jī)制將有助于指導(dǎo)卵巢癌臨床治療。胰島素樣生長(zhǎng)因子（包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ）可促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制凋亡，在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅱ蛋白酶解轉(zhuǎn)化過程

2、與IGF-Ⅱ的生物學(xué)功能密切相關(guān)，IGF-Ⅱ前體多肽（proIGF-Ⅱ，156個(gè)氨基酸）可經(jīng)修飾轉(zhuǎn)化為兩個(gè)大的IGF-Ⅱ肽（big IGF-Ⅱ，分別含有87、104個(gè)氨基酸）和成熟IGF-Ⅱ（mIGF-Ⅱ，67個(gè)氨基酸）。在某些病理狀況下，IGF-Ⅱ各肽比例發(fā)生改變，提示不同IGF-Ⅱ肽可能具有不同的生物學(xué)活性。IGFs作用受其6個(gè)結(jié)合蛋白（IGFBP1～6）調(diào)節(jié)。IGF-Ⅰ以及不同IGF-Ⅱ肽與IGFBPs的結(jié)合活性以及相關(guān)生物功能各

3、不相同。在所有IGF結(jié)合蛋白中，IGFBP-3在血漿中的濃度最高，其次為IGFBP-2。IGFBP-3是一種潛在的抗細(xì)胞增生蛋白，可以抑制腫瘤細(xì)胞增生，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。血漿IGFBP-3水平的降低與多種惡性腫瘤有關(guān)。IGFBP-3抗細(xì)胞增生的作用主要是可以和IGF-Ⅰ以及IGF-Ⅱ形成復(fù)合物，進(jìn)而阻止它們激活I(lǐng)GF-Ⅰ受體以及由此誘導(dǎo)的細(xì)胞增生，另外，IGFBP-3也可以通過不依賴于IGF的機(jī)制而起作用。IGFBP-2在許多惡性腫瘤中

4、的表達(dá)都明顯升高，且與腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲性有關(guān)。IGFBP-2水平升高亦可增加卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲性。體外研究表明卵巢上皮性癌細(xì)胞株可表達(dá)所有與IGF家族有關(guān)的因子。盡管IGF家族各因子在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后中分別起到一定的作用，但血循環(huán)中主要IGFBPs對(duì)IGF-Ⅱ生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用以及對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響和化療耐藥性的相關(guān)性尚不清楚。本研究應(yīng)用新近改良的Western Ligand Blot（WLB）以及Werter

5、n Blot（WB）方法檢測(cè)卵巢良性、交界性和惡性腫瘤患者微量血清（0.5μl）中IGF-Ⅱ各肽和其主要結(jié)合蛋白IGFBP-2，IGFBP-3的含量以及相關(guān)性，探討血循環(huán)中IGFBP-2，IGFBP-3改變對(duì)IGF-Ⅱ生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用，以及血循環(huán)與癌組織中IGFBP-2和IGFBP-3表達(dá)的相關(guān)性和相應(yīng)的臨床病理學(xué)特征，同時(shí)，應(yīng)用敏感和耐藥的卵巢上皮性癌細(xì)胞株研究IGFBP-3在卵巢癌化療耐藥中的作用以及相應(yīng)機(jī)制，從而為探討IGF-

6、Ⅱ以及IGFBP-2，IGFBP-3作為卵巢上皮性癌診斷、病情監(jiān)測(cè)和療效評(píng)價(jià)的生物學(xué)標(biāo)記物提供依據(jù)。
　　 第一部分卵巢腫瘤患者IGF-Ⅱ以及IGFBP-2和IGFBP-3的檢測(cè)及臨床意義
　　 目的：檢測(cè)IGF-Ⅱ（pto-，big-，mIGF-Ⅱ），IGFBP-2及IGFBP-3在卵巢良性、惡性腫瘤患者血清中的含量，探討其與卵巢腫瘤的鑒別診斷和臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，研究是否聯(lián)合檢測(cè)IGF-Ⅱ及其相應(yīng)結(jié)合蛋白IGFB

7、P-2，IGFBP-3可作為卵巢癌診斷和治療監(jiān)測(cè)的指標(biāo)之一。
　　 方法：抽提滴加于濾紙上的微量血清，并采用Western Ligand Blot（WLB）和Wertern Blot（WB）方法分別檢測(cè)23例卵巢上皮性癌（漿液性囊腺癌15例，粘液性囊腺癌8例），7例交界性腫瘤，20例卵巢良性上皮性腫瘤（其中漿液性囊腺瘤11例，粘液性囊腺瘤9例），22例婦科其他良性疾病患者以及21例婦科其他惡性腫瘤患者微量血清（0.5μl）中IG

8、F-Ⅱ各不同肽，IGFBP-2及IGFBP-3含量，同時(shí)以20例相應(yīng)年齡健康婦女血清做正常對(duì)照。另外，分別對(duì)其中8例卵巢癌患者進(jìn)行術(shù)前、術(shù)后以及化療1個(gè)療程后血清進(jìn)行IGF-Ⅱ，IGFBP-2，及IGFBP-3含量檢測(cè)。
　　 結(jié)論：
　　 1.卵巢癌患者血清中IGFBP-2水平明顯升高，可能與瘤負(fù)荷有關(guān)，而IGFBP-3水平的明顯降低則可能有助于腫瘤生長(zhǎng)；
　　 2.卵巢癌患者血清中IGF-Ⅱ（包括pro-，b

9、ig-和mIGF-Ⅱ）水平均顯著降低，可能標(biāo)志著IGF-Ⅱ生物學(xué)活性的改變；
　　 3.卵巢癌患者術(shù)后及化療后血清pro-，big-和mIGF-Ⅱ以及IGFBP-2，IGFBP-3相繼恢復(fù)至正常水平，提示聯(lián)合檢測(cè)血清IGF-Ⅱ各肽以及IGFBP-2和IGFBP-3含量有助于判斷卵巢癌患者的治療效果。
　　 4.IGF-Ⅱ各肽及IGFBP-2，IGFBP-3水平與CA125均有明顯的相關(guān)性，聯(lián)合檢測(cè)上述指標(biāo)有助于篩查導(dǎo)致C

10、A125升高的一些良性婦科疾病及部分婦科惡性腫瘤，提高卵巢上皮性癌診斷的準(zhǔn)確性和特異性。
　　 5.本研究應(yīng)用改良的WLB和WB方法檢測(cè)從濾紙抽提的卵巢腫瘤患者微量血清中不同IGF-Ⅱ肽以及IGFBP-2，IGFBP-3蛋白含量，與傳統(tǒng)的蛋白檢測(cè)方法相比具有高度靈敏度，為卵巢癌以及其他疾病大樣本篩查以及地區(qū)性研究提供了可行性的血清學(xué)檢測(cè)途徑。
　　 第二部分IGFBP-2及IGFBP-3對(duì)卵巢上皮性癌患者IGF-Ⅱ生物學(xué)

11、功能的調(diào)節(jié)
　　 目的：檢測(cè)卵巢癌患者血清IGFBP-2及IGFBP-3與IGF-Ⅱ各肽的相關(guān)性，研究IGFBP-2和IGFBP-3對(duì)IGF-Ⅱ生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：采用免疫沉淀（IP）方法確定血循環(huán)中IGF-Ⅱ與IGFBP-2及IGFBP-3的結(jié)合狀況。血清標(biāo)本分別應(yīng)用IGFBP-2，IGFBP-3特異性抗體吸附沉淀（IP）后，再分別經(jīng)WB測(cè)定血清中IGF-Ⅱ各肽的含量，并通過WLB確定血清中特異吸附沉淀

12、的IGFBP-2及IGFBP-3含量，另外，通過應(yīng)用IGF-Ⅱ/IHGFBP交叉連接復(fù)合物測(cè)定（Cross-link）方法分別檢測(cè)卵巢癌患者血清和正常對(duì)照者血清中呈結(jié)合狀態(tài)的IGF-IGFBPs。
　　 結(jié)論：
　　 1.卵巢癌患者血清IGFBP-2，IGFBP-3的改變與IGF-Ⅱ各肽含量的下降明顯相關(guān)，IGFBP-3明顯降低而IGFBP-2明顯升高的狀況可改變其與big/mIGF-Ⅱ的結(jié)合狀況，進(jìn)而導(dǎo)致游離IGF-Ⅱ

13、增加而到達(dá)相應(yīng)靶組織發(fā)揮作用并降解。
　　 2.本研究結(jié)果提示血循環(huán)中IGFBP-2和IGFBP-3的改變可導(dǎo)致IGF-Ⅱ生物學(xué)活性增強(qiáng)，揭示IGFBP-2和IGFBP對(duì)卵巢癌患者IGF-Ⅱ生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 第三部分IGFBP-2及IGFBP-3在卵巢腫瘤患者組織中的表達(dá)及臨床意義
　　 目的：檢測(cè)卵巢良性、惡性腫瘤患者組織中IGFBP-2以及IGFBP-3的表達(dá)，探討其與卵巢癌臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性

14、，并進(jìn)一步探討IGFBP-2及IGFBP-3在卵巢癌發(fā)生和發(fā)展中可能的作用以及作為卵巢上皮性癌生物學(xué)標(biāo)記的可能性。
　　 方法：采用免疫組化染色方法檢測(cè)卵巢腫瘤組織（卵巢良性腫瘤8例，卵巢交界性腫瘤8例，卵巢癌上皮性癌23例，包括高、中度分化者15例，低度分化者8例）中IGFBP-2和IGFBP-3的表達(dá)。同時(shí)以4例正常卵巢組織（來(lái)自于因其他婦科疾病須行全部或部分卵巢切除的患者，并經(jīng)病理證實(shí)無(wú)卵巢組織病變）作為對(duì)照。
　　

15、 結(jié)論：本研究中發(fā)現(xiàn)卵巢腫瘤組織細(xì)胞中IGFBP-2和IGFBP-3的表達(dá)不僅與腫瘤的良、惡性有關(guān)，而且與卵巢癌細(xì)胞的分化程度有一定相關(guān)性，說明在組織細(xì)胞中IGFBP-2及IGFBP-3的表達(dá)與卵巢癌患者的I臨床病理學(xué)特征有關(guān)。
　　 第四部分IGFBP-3在卵巢癌化療耐藥中的調(diào)節(jié)作用
　　 目的：應(yīng)用鉑類敏感和耐藥的卵巢上皮性癌細(xì)胞株檢測(cè)IGFBP-3在卵巢化療耐藥中的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 方法：分別建立I

16、GFBP-3完整段以及1-97N末端質(zhì)粒cDNA，應(yīng)用兩對(duì)鉑類敏感和耐藥的卵巢上皮性癌細(xì)胞株（OV2008/C13*，A2780s/A2780cp）經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)、IGFBP-3轉(zhuǎn)染伴有或不伴有DN-Akt病毒感染，再經(jīng)過CDDP（0，2.5，5，10μM；24 h）處理后，檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞的凋亡以及相應(yīng)Caspase-3改變情況。
　　 結(jié)論：
　　 1.CDDP誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞的凋亡與IGFBP-3有一定相關(guān)性。