三種中藥制劑促化療增敏作用的體外實(shí)驗(yàn).pdf

1、背景和目的
　　 癌癥嚴(yán)重威脅人們的生命健康,其發(fā)病率近年來(lái)逐漸增加,近10年來(lái)增加更為明顯。早期的腫瘤患者主要采取外科手術(shù)的治療方法,但是許多患者發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)已經(jīng)發(fā)展到中晚期,不再適合手術(shù)切除,化療成為主要的治療手段。在腫瘤臨床實(shí)踐中我們經(jīng)常發(fā)現(xiàn):一些生長(zhǎng)不快、病理分化好的惡性腫瘤對(duì)化療藥敏感性差；然而一些生長(zhǎng)很快、病理分化級(jí)別低的惡性腫瘤對(duì)化療藥敏感性卻很好。導(dǎo)致此種情況發(fā)生的一個(gè)重要因素就是病理類(lèi)型不同的腫瘤細(xì)胞處于不同的細(xì)

2、胞分裂周期,因而,單獨(dú)使用周期特異性的化療藥不會(huì)達(dá)到全部殺死所有癌細(xì)胞的目的。目前惡性腫瘤的綜合治療已經(jīng)被腫瘤臨床醫(yī)師廣為接受,中醫(yī)藥的治療手段也是腫瘤綜合治療方案中的重要一環(huán)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明中藥可以通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能和直接殺死腫瘤細(xì)胞等途徑來(lái)達(dá)到抗腫瘤的療效。杜仲、菟絲子和肉蓯蓉都是常用的補(bǔ)益類(lèi)中藥。據(jù)報(bào)道,杜仲提取物可促進(jìn)大鼠膠原蛋白合成和表皮細(xì)胞的增殖；菟絲子總黃酮對(duì)成骨細(xì)胞活性有促進(jìn)作用,并且可促進(jìn)小鼠免

3、疫器官胸腺、脾臟增長(zhǎng),提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能,促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)；肉蓯蓉多糖也能夠明顯提高巨噬細(xì)胞的吞噬和分泌功能,活化巨噬細(xì)胞,并可明顯促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖。據(jù)此,我們是否可以推測(cè)這三位補(bǔ)益中藥對(duì)腫瘤細(xì)胞也有一定促增殖作用呢?其是否具有一定促進(jìn)腫瘤細(xì)胞代謝的作呢?補(bǔ)益中藥是否具有改變腫瘤細(xì)胞周期時(shí)相的作用,使腫瘤細(xì)胞經(jīng)中藥作用后集中到某一細(xì)胞周期時(shí)相,如S期、G1期或者M(jìn)期,然后再使用某一周期特異性化療藥物殺滅之,從而提高了腫瘤細(xì)

4、胞對(duì)化療藥的敏感性?
　　 方法：
　　 1細(xì)胞培養(yǎng)將食管癌細(xì)胞Ec9706接種于含體積分?jǐn)?shù)10％滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。在37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO2、相對(duì)濕度為95％的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。1～2d換液一次,1～2d或2～3d傳代。
　　 2 MTT法初步篩選出最能促使食管癌細(xì)胞Ec9706生長(zhǎng)的三位中藥
　　 3測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)增殖率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ec9706細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,接種于

5、96孔板中。每孔大約1000～3000個(gè)腫瘤細(xì)胞,體積100μl,培養(yǎng)24小時(shí)后,按預(yù)先設(shè)計(jì)將不同濃度中藥試劑加入孔中,體積為100μl,每組設(shè)置若干重復(fù)孔,分別設(shè)置空白對(duì)照孔、調(diào)零孔和本底對(duì)照孔。在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后,利用噻唑藍(lán)(MTT)還原法檢測(cè)藥物組細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖率。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。
　　 4繪制出三位中藥的生長(zhǎng)曲線取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Ec9706細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,接種于96孔板中。每孔約10

6、00～3000個(gè)細(xì)胞,體積為100μl,培養(yǎng)24h后,分別將40mg/ml杜仲試劑、20mg/ml菟絲子試劑,30mg/ml肉蓯蓉試劑加入板中,每孔100μl,每天取出一板,以MTT法進(jìn)行比色檢測(cè),記錄OD值,共記錄6天,繪制生長(zhǎng)曲線。
　　 5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期
　　 6用免疫細(xì)胞化學(xué)分析細(xì)胞周期蛋白D的表達(dá)情況S-P染色法分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組Ec9706細(xì)胞中cyclinD蛋白的表達(dá)情況。
　　 7通過(guò)MT

7、T法測(cè)定中藥聯(lián)合5-fu對(duì)Ec9706細(xì)胞的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ec9706細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,接種于96孔板中。每孔約1000～3000個(gè)細(xì)胞,體積為100μl,培養(yǎng)12h后,按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將最佳濃度的中藥制劑和5-fu加入孔中,體積為100μl,分別設(shè)單獨(dú)5-fu組,5-fu加中藥組和空白對(duì)照組,每組設(shè)置若干重復(fù)孔。在37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h、48h、72h后,采用噻唑藍(lán)(MTT)還原法檢測(cè)各組細(xì)胞的生長(zhǎng)

8、抑制率。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。
　　 8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0,采用單因素方差分析及x2檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1經(jīng)MTT法測(cè)定出諸位補(bǔ)益類(lèi)中藥促增殖作用最明顯的三位中藥是杜仲、菟絲子、肉蓯蓉。
　　 杜仲、菟絲子、肉蓯蓉在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)食管癌細(xì)胞株Ec9706有一定促增殖作用。杜仲促增殖的濃度范圍在1-40mg/ml,且40mg/ml時(shí)的增殖作用最明

9、顯。菟絲子的促增殖濃度范圍在1-20mg/ml,且20mg/ml時(shí)增殖作用最明顯。肉蓯蓉促增殖濃度范圍在1-30mg/ml,且30mg/ml時(shí)增殖作用最明顯。以上各濃度組的增殖率與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)
　　 2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布
　　 藥物作用于細(xì)胞72h后,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期各時(shí)相的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比與對(duì)照組比較有明顯的不同。S期細(xì)胞百分率明顯升高,G1期細(xì)胞百分率明顯下降。實(shí)驗(yàn)組細(xì)

10、胞S期百分率與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3細(xì)胞免疫化學(xué)對(duì)Ec9706細(xì)胞周期蛋白D表達(dá)的檢測(cè)
　　 經(jīng)藥物作用后的實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組均有cyclinD蛋白表達(dá),陽(yáng)性部位位于胞核和胞漿。經(jīng)杜仲作用后的Ec9706細(xì)胞cyclinD蛋白陽(yáng)性表達(dá)率0.642±0.033,經(jīng)菟絲子作用后的Ec9706細(xì)胞cyclinD蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為0.632±0.022,經(jīng)肉蓯蓉作用后的Ec9706細(xì)胞cycli

11、nD蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為0.562±0.023,對(duì)照組細(xì)胞cyclinD蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為0.426±0.029。
　　 4三種中藥制劑的最佳濃度聯(lián)合5-fu化療提高了5-fu對(duì)Ec9706的抑制作用,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1杜仲、菟絲子、肉蓯蓉對(duì)食管癌Ec9706細(xì)胞均具有一定的促增殖作用。
　　 2經(jīng)杜仲、菟絲子、肉蓯蓉作用后的食管癌Ec9706細(xì)胞各周期時(shí)相,