鈦顆粒對(duì)異位骨化局部干預(yù)的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：
　　 通過(guò)建立鈦顆粒局部干預(yù)抑制異位骨化形成的動(dòng)物模型,初步探討鈦顆粒抑制異位骨形成的可能性和發(fā)生機(jī)制,為異位骨化的防治提供一個(gè)新的方法開拓新的思路。
　　 方法：
　　 制備動(dòng)物模型:36只昆明小鼠于雙側(cè)跟腱中點(diǎn)行跟腱切斷術(shù),跟腱切斷部位左側(cè)注射鈦顆粒的懸濁液為實(shí)驗(yàn)組,右側(cè)注射生理鹽水為對(duì)照組。分別在跟腱切斷后于第4、8、12周隨機(jī)處死12只小鼠。對(duì)處死小鼠拍攝X片,并將切取的跟腱組織分成兩份,分別進(jìn)行

2、HE染色和免疫組化分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.X片顯示跟腱切斷術(shù)后第8周對(duì)照組跟腱切斷部位58.3％(7/12)出現(xiàn)異位骨化；12周后,對(duì)照組跟腱部位均出現(xiàn)異位骨化,實(shí)驗(yàn)組跟腱部位有1例出現(xiàn)異位骨化。
　　 2.HE組織學(xué)表明,該方法形成的異位骨化為軟骨內(nèi)成骨。
　　 3.跟腱部組織免疫組化結(jié)果顯示:①BMP-2、TGF-β在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組均少于對(duì)照組,但兩組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；②

3、IL-1、TNF-a的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐步減少,各個(gè)時(shí)期實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)明顯高于對(duì)照組,兩組間有顯著性的差異(P<0.05)；③Runx2/Cbfa1在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組減少,并且在術(shù)后第4周、第8周時(shí)兩組間有顯著性差異(P<0.05)；④MMP-9在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組,并且在術(shù)后第8周、第12周兩組間有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論；
　　 1.跟腱切斷的方法可以有效誘導(dǎo)異位骨化,結(jié)

4、果穩(wěn)定可靠；
　　 2.鈦顆粒局部干預(yù)可以防止以軟骨內(nèi)成骨方式發(fā)生的異位骨化的形成,其機(jī)制可能為鈦顆粒在部分抑制成骨的同時(shí),增強(qiáng)了周圍組織的破骨細(xì)胞活性產(chǎn)生溶骨效應(yīng)。
　　 目的:
　　 1.探討鈦微粒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放破骨性細(xì)胞因子的作用。
　　 2.觀察鈦顆粒對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響,探討鈦顆粒防治異位骨化形成的可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.巨噬細(xì)胞細(xì)胞RAW264.7

5、分別與不同濃度的鈦微粒聯(lián)合培養(yǎng),分別在24 h、48h、72h時(shí)點(diǎn)取細(xì)胞培養(yǎng)上清液,用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)技術(shù)檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和前列腺素E2(PGE2)的含量。
　　 2.RT-PCR法和Western blot法分析鈦顆粒干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NFATcl在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.鈦顆粒組較對(duì)照組TNF-α

6、、IL-1、IL-6和PGE2分泌量明顯增高(P<0.05),且隨濃度增高其分泌量增加；
　　 2.鈦顆粒刺激后NFATcl在mRNA和蛋白水平的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 鈦顆粒具有誘導(dǎo)前破骨細(xì)胞RAW264.7分泌破骨性細(xì)胞因子的作用,并刺激其向破骨細(xì)胞分化。
　　 目的:
　　 通過(guò)建立小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1和鈦顆粒體外共同培養(yǎng)的細(xì)胞模型,研究鈦顆粒對(duì)小鼠前成

7、骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖、分化、礦化及Runx2/Cbfα1、OPG、RANKL表達(dá)的影響,探討鈦顆粒通過(guò)作用于前成骨細(xì)胞進(jìn)而影響骨代謝的可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.MC3T3-E1細(xì)胞在含β2甘油磷酸鈉、抗壞血酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)22 d。用鈦顆粒干預(yù)小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1(顆粒數(shù)與細(xì)胞數(shù)之比為100:1),在細(xì)胞培養(yǎng)的不同時(shí)間(2,4,7,14 d),用四甲基偶氮唑鹽檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性；用p-NPP法

8、測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)活性；Van GieSon苦味酸酸性復(fù)紅染色法染色細(xì)胞Ⅰ型膠原；茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成；
　　 2.用RT-PCR和Western blot的方法檢測(cè)不同時(shí)間細(xì)胞中Runx2/Cbfα1在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況。
　　 3.用RT-PCR和Western blot的方法檢測(cè)細(xì)胞在不同鈦顆粒濃度下OPG、RANKL在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1

9、.鈦顆粒組與對(duì)照組相比各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖均受抑制,且有顯著性差異(P<0.05)；14 dⅠ型膠原染色可見鈦顆粒組較對(duì)照組弱,堿性磷酸酶活性定量分析鈦顆粒組顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；14,21 d茜素紅染色可見鈦顆粒組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量較對(duì)照組顯著性降低(P<0.05)；
　　 2.在不同時(shí)間點(diǎn)鈦顆粒組MC3T3-E1細(xì)胞中Runx2/Cbfα1的mRNA和蛋白表達(dá)較單純誘導(dǎo)組顯著下調(diào)(P<0.05)；
　　 3.鈦顆粒能上