應(yīng)用COX-2分子熒光探針檢測肝細(xì)胞肝癌的研究.pdf

1、背景:肝癌早期診斷十分困難，往往在進(jìn)展期才能被診斷。環(huán)氧化酶-2是一種關(guān)鍵酶，其作用十分重要，并影響肝癌的發(fā)生與發(fā)展，呈高表達(dá)[1]，有報道稱，它在早期人類肝細(xì)胞肝癌發(fā)生的就具有作用，并且COX-2是HCC向惡性轉(zhuǎn)化的預(yù)測性標(biāo)志[2]。根據(jù)COX-2的這一特點，找到一種及時、準(zhǔn)確、安全且直觀的檢測手段，無疑大有助益。
　　目的:人類肝細(xì)胞肝癌(HCC)是一種常見的惡性癌癥，盡管近年來化療藥物、放射療法和手術(shù)技術(shù)取得了長足進(jìn)展，但由

2、于診斷延誤，HCC患者的預(yù)后仍然很差，對肝細(xì)胞肝癌的早期診斷還是十分困難的。由于發(fā)現(xiàn)晚，從而錯失最佳治療的時機(jī)。如何提高臨床研究肝細(xì)胞肝癌的早期診斷率，是科學(xué)工作者關(guān)注的焦點。COX-2是一種酶，有報道稱，它在HCC中高表達(dá)，COX-2表達(dá)量的多少還與HCC患者的復(fù)發(fā)率和生存率有一定的關(guān)系?；谶@些，我們與大連理工大學(xué)合作，合成了一種探針—ANQ-IMC-6，它的特點就是能特異性的標(biāo)記COX-2蛋白并識別肝細(xì)胞肝癌。
　　方法:使

3、用ANQ-IMC-6或者COX-2的特異性抑制劑NS-398預(yù)處理HepG2胞（人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞）。這些細(xì)胞和人正常肝組織細(xì)胞(L02)用ANQ-IMC-6進(jìn)行處理，并通過共聚焦顯微鏡觀察。HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞中COX-2的表達(dá)使用westernblotting檢測。觀察到COX-2主要富集在癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，我們使用ANQ-IMC-6對HepG2進(jìn)行標(biāo)記，并使用BODIPY TR C5-ceramide對HepG2細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染，

4、BODIPY TR C5-ceramide能特異性染色高爾基復(fù)合體，觀察COX-2是否在高爾基復(fù)合體上富集。為了檢測ANQ-IMC-6是否能對肝癌組織和正常肝臟組織進(jìn)行區(qū)分，我們使用ANQ-IMC-6對病人的肝癌組織和癌旁組織進(jìn)行了染色。
　　結(jié)果:1.HepG2細(xì)胞中COX-2特異性高表達(dá)，而L02細(xì)胞中陰性表達(dá)。2.ANQ-IMC-6染色的細(xì)胞中，HepG2細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)部位呈現(xiàn)出高強(qiáng)度的綠色熒光，相反，在L02細(xì)胞中則沒有

5、任何熒光信號被接收到。3.事先用NS-398處理過的HepG2細(xì)胞在使用ANQ-IMC-6染色的過程中呈現(xiàn)出熒光信號強(qiáng)度被明顯抑制的現(xiàn)象。4.用ANQ-IMC-6和BODIPY TR C5-ceramide對HepG2細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染，其結(jié)果顯示出COX-2定位于高爾基復(fù)合體上（皮爾遜相關(guān)系數(shù)=0.89）。5.用ANQ-IMC-6對組織塊進(jìn)行染色，結(jié)果表明ANQ-IMC-6可以區(qū)分開肝癌組織和癌旁組織。
　　結(jié)論:1、蛋白質(zhì)印跡法檢測

6、顯示COX-2在肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，在正常肝細(xì)胞中不表達(dá)。使用ANQ-IMC-6對兩種細(xì)胞染色可以得到相同的結(jié)果，ANQ-IMC-6可以在癌癥細(xì)胞中被點亮，說明ANQ-IMC-6具有應(yīng)用于區(qū)分肝癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的前景。2、ANQ-IMC-6對肝癌細(xì)胞的染色強(qiáng)度可以被NS-398所抑制，其熒光強(qiáng)度(1567.95±178.21)與未經(jīng)NS-398預(yù)處理過的ANQ-IMC-6標(biāo)記的HepG2細(xì)胞的熒光強(qiáng)度(2879.74±185.69)

7、相比，有明顯的減弱(P＜0.05;圖3)，說明ANQ-IMC-6確實能夠特異性的綁定在COX-2上。3、被ANQ-IMC-6標(biāo)記的COX-2定位于被BODIPY TR C5-ceramide標(biāo)記了的高爾基復(fù)合體上，為應(yīng)用熒光探針ANQ-IMC-6分析COX-2在活細(xì)胞中亞細(xì)胞分布和表達(dá)提供了十分有價值的材料。4、使用從患有原發(fā)性肝癌的病人身上取下兩塊相似大小的腫瘤組織與癌旁組織，并對其使用ANQ-IMC-6進(jìn)行染色，成功快速的區(qū)分了肝細(xì)