HMGB1的原核表達(dá)以及對人骨髓MSC生物學(xué)特性的作用研究.pdf

1、HMGBl可促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖、遷移、分化以及細(xì)胞骨架重建和傷口愈合，因此被歸為一類新的具有細(xì)胞趨化作用的組織修復(fù)信號分子。人體內(nèi)的MSC是無組織特異性的組織修復(fù)啟動細(xì)胞，多種趨化因子和組織損傷信號分子可以動員MSC，并在特定條件下誘導(dǎo)其分化為構(gòu)成結(jié)締組織的細(xì)胞。推測HMGBl很可能會影響MSC的遷移、增殖和分化等生物學(xué)特性。因此，本研究觀察了HMGBl對MSC表型、增殖、遷移，以及向成骨、成軟骨和成脂肪分化性能的影響及其相關(guān)機(jī)制。

2、 通過RT-PCR方法擴(kuò)增出人HMGBl的全長編碼基因，克隆于原核表達(dá)載體pET-24a-d(+)，從而構(gòu)建了HMGBl的原核表達(dá)載體；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過親和層析方法純化得到了HMGBl融合蛋白。該蛋白在體外能夠誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞的遷移，證明具有生物學(xué)活性。從人骨髓中分離并培養(yǎng)了MSC，鑒定了其免疫表型和多向分化潛能。RT-PCR方法證實(shí)MSC表達(dá)HMGBl的受體RAGE和TLR-4。在此基礎(chǔ)上較系統(tǒng)研究了HMGBl對MS

3、C生物學(xué)特性的影響。 1．HMGBl對MSC免疫表型的影響。25ng／ml的HMGBl作用2周后，MSC的免疫表型CD29、CDl66、CD73、HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)均未發(fā)生明顯變化，提示此濃度的HMGBl不影響其免疫表型。 2．HMGBl對MSC向成骨細(xì)胞分化特性的影響。HMGBl可提高M(jìn)SC的ALP活性，且上調(diào)向成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志基因和轉(zhuǎn)錄因子(OPN、OCN、ALP、runx2)的表達(dá)。但并不能體

4、外誘導(dǎo)MSC形成骨結(jié)節(jié)以及隨后的礦化。因此，HMGBl雖然能促進(jìn)骨髓MSC向成骨細(xì)胞分化，但不能誘導(dǎo)MSC分化為成熟的骨細(xì)胞。為了探索HMGBl影響MSC向骨系列分化的機(jī)制，用中和性抗RAGE抗體阻斷MSC表面的RAGE后檢測了MSC向成骨分化過程中標(biāo)志基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，OPN和ALP在RNA水平無明顯變化；vonKossa染色結(jié)果表明，僅加HMGBl的培養(yǎng)孔內(nèi)無骨基質(zhì)沉積，但是另外加有抗RAGE抗體的則有骨基質(zhì)沉積，即阻斷RAGE

5、抑制了HMGBl對MSC向成骨細(xì)胞分化的作用。因此，HMGBl誘導(dǎo)MSC向成骨細(xì)胞分化的過程依賴于與RAGE結(jié)合。 3．HMGBl對MSC向軟骨和脂肪細(xì)胞分化的作用。HMGBl作用后第3天MSC即表達(dá)X型膠原和分化特異性轉(zhuǎn)錄因子sox5、sox6和sox9，提示HMGBl可促進(jìn)MSC向軟骨系列分化。但封閉RAGE后，X型膠原和sox5并無明顯變化，提示此作用不依賴RAGE受體。此外，雖然HMGBl可誘導(dǎo)MSC形成極少數(shù)的脂肪小泡

6、，但并沒有典型的脂肪細(xì)胞形成，且不能上調(diào)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因PPAR72的表達(dá)，因此HMGBl不能誘導(dǎo)MSC向脂肪細(xì)胞分化。 4．HMGBl促進(jìn)MSC的增殖和遷移。HMGBl可促進(jìn)MSC的增殖并且具有較明顯的促進(jìn)MSC遷移的作用。為了探討HMGBl促進(jìn)MSC遷移的機(jī)制，研究了HMGBl與SPK-S1P-EDG細(xì)胞信號通路的關(guān)系，表明：(1)MSC表達(dá)S1P的特定受體EDGl、3和5；(2)HMGBl能明顯增強(qiáng)SPK的活性，并且呈