克羅恩病的內(nèi)鏡學(xué)特點及病因?qū)W研究.pdf

1、背景和目的： 克羅恩病(Crohn’s disease,CD)是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的一個主要類型，是一種腸道節(jié)段性分布的，慢性透壁性炎性肉芽腫性疾病，可見于全消化道，好發(fā)于小腸，多為小腸結(jié)腸炎。CD在歐美國家較為常見，發(fā)病率約為1～10/10萬左右。我國患病率較低，無確切統(tǒng)計，但近20年來，隨著國內(nèi)臨床醫(yī)生對CD的認識加深，以及雙氣囊小腸內(nèi)鏡的應(yīng)用，CD發(fā)病率在我國有逐年上

2、升趨勢。該病病因及發(fā)病機制至今不明，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，易誤診，目前尚無徹底治愈方法，常用藥物治療效果欠佳，罹患者即使在手術(shù)切除病變腸段后，也可能會復(fù)發(fā)而成為終身致殘性疾病，嚴重危害人類健康。 近年來的觀點認為，攜帶遺傳易感基因的宿主在環(huán)境因素參與下，免疫功能紊亂，最終導(dǎo)致疾病發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)NOD2/CARDl5基因序列單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide Polymorphisms，SNP)與CD明顯相關(guān)，發(fā)現(xiàn)并證

3、實其第4、8、11上有3個SNP(R702W, G908R，3020 insC)與歐美白種人CD顯著相關(guān)，并且認為NOD2/CARDl5基因突變與發(fā)病年齡、病變部位及臨床特征有關(guān)。上述現(xiàn)象在德國、澳大利亞及英國等人群中均得到驗證，但在日本、我國香港和浙江地區(qū)的小樣本研究并未發(fā)現(xiàn)上述3個SNP的改變。由于CD存在著明顯的種族差異性，相對于西方人群的易感基因不一定適用于我國人群，而且CD同其它復(fù)雜疾病一樣，單一基因改變并不一定能引起疾病的發(fā)

4、生，基因之間的相互作用以及同環(huán)境之間的相互作用更能解釋疾病的發(fā)病機理，因此，確定我國人群CD發(fā)病相關(guān)的易感基因，進行連鎖及群體關(guān)聯(lián)分析，對闡明我國漢族人群CD的發(fā)生發(fā)展顯得更為緊迫。 目前，國外多項研究證明CD是一種復(fù)雜的多基因疾病，遺傳因素與環(huán)境因素相互作用導(dǎo)致CD的發(fā)病已逐漸被認可，因此，從基因水平上研究CD的發(fā)生發(fā)展及臨床特征，是目前研究的主流，其主要任務(wù)是闡明其發(fā)病的病因及發(fā)病機制，尋找其相關(guān)的易感基因，對這一研究的突破

5、不僅能使我們更好地理解CD發(fā)生的病理生理機制，而且還將能指導(dǎo)我們對CD進行早期診斷、預(yù)防和治療。 NOD2/CARDl5基因已被證實在白色人種CD發(fā)病中起重要作用，與顯著相關(guān)的NOD2/CARDl5基因的SNP位點有R702W、G908R、3020insC等。NOD2/CARD15基因是否是中國CD的易感基因，這些位點與中國人CD發(fā)病是否相關(guān)，以及是否存在其他與中國人CD發(fā)病相關(guān)的NOD2/CARDl5基因突變位點?目前尚無相關(guān)

6、報道。我們擬對NOD2/CARD15基因12個外顯子進行DNA測序，用PCR-RFLP法驗證突變位點并探討其在潰瘍性結(jié)腸炎(ulccerativecolitis，UC)及健康人群的分布頻率，發(fā)現(xiàn)與中國人CD發(fā)病相關(guān)的SNP以及SNP與CD臨床特征的相關(guān)性，為進一步研究CD發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)，為防治該病提供理論依據(jù)。同時，為了提高克羅恩病的鏡下診斷，本研究回顧性分析155例經(jīng)雙氣囊內(nèi)鏡檢查的患者，以探討雙氣囊內(nèi)鏡對小腸疾病的診斷價值。

7、 方法： 1．成功擴增48例CD患者NOD2/CARDl5基因12個外顯子后，將PCR產(chǎn)物純化，然后通過ABl377和ABl3730測序儀采用雙脫氧四色熒光法全自動測讀序列，并與基因庫數(shù)據(jù)對照，發(fā)現(xiàn)突變位點后，對該序列進行反向測序，明確該突變位點確實存在，并用同樣的一對引物擴增50例潰瘍性結(jié)腸炎患者和50例健康者NOD2/CARD15基因相應(yīng)目的片斷，純化PCR產(chǎn)物，用同樣的方法測序并與基因庫數(shù)據(jù)對照。 2．根據(jù)P26

8、8S突變位點設(shè)計酶切引物及選擇相應(yīng)的內(nèi)切酶，PCR擴增目的片段，成功擴增后，用BamHI酶切鑒定已發(fā)現(xiàn)的P268S突變位點。并探討其在UC組及健康者組中的發(fā)生頻率。 3．通過轉(zhuǎn)化、擴增出野生型NoD2蛋白真核表達載體(pcDNA-wild-NOD2-HA)，應(yīng)用定點突變技術(shù)構(gòu)建、克隆出P268S突變型NOD2蛋白真核表達載體(pcDNA-NOD2-P268S-HA)。 4．成功構(gòu)建出P268S突變型NOD2蛋白真核表達載

9、體后，把實驗分成空白對照組、pcDNA3.0 空載體組、 pcDNA-wild-NOD2-HA 組，pcDNA-NOD2-P268S-HA共4組；利用陽離子質(zhì)脂體介導(dǎo)體外轉(zhuǎn)染技術(shù)瞬時轉(zhuǎn)染人胚腎細胞，再通過western Blot及RT-PCR法檢測NOD2蛋白的表達。 5．各實驗組瞬時轉(zhuǎn)染48小時后LPS刺激細胞30分鐘，然后用western Blot及免疫熒光定位技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染細胞中的NF-K B核內(nèi)移變化，比較各實驗組中核

10、內(nèi)NF-K B的表達水平。 結(jié)果： 1．155例行雙氣囊小腸內(nèi)鏡檢查的患者中125例發(fā)現(xiàn)病變，陽性率為80.6％，檢出的主要疾病有小腸潰瘍(含克羅恩病)、慢性炎癥、Meckel憩室、間質(zhì)瘤、血管畸形、小腸癌等。其中92例懷疑小腸出血者，84例檢出病變，陽性率91.3％；39例腹痛患者，檢出病變24例，陽性率61.5％；腹瀉、腹脹、消瘦的23例，檢出病變16例，陽性率69．6％；1例腹瀉伴頑固性低蛋白血癥者診斷為淋巴管擴張

11、癥。病變分布，位于胃及十二指腸9例，小腸病變115例，大腸病變1例，全消化道未發(fā)現(xiàn)病變30例。小腸病變者中潰瘍性病變43例，其主訴為反復(fù)消化道出血者27例，腹痛9例，腹脹4例，消瘦2例，腹瀉1例；病灶數(shù)為單個的12例，多個(2個及以上)31例；病變位于空腸的18例，回腸20例，空腸和回腸都有病變的5例。雙氣囊內(nèi)鏡結(jié)合組織學(xué)檢查對Meckel憩室、間質(zhì)瘤、癌、血管病變、腸黏連的診斷，與手術(shù)后診斷是完全相符的；而對潰瘍性病變(主要是克羅恩病

12、) 診斷與手術(shù)后診斷卻相差較大，符合率為4/7(57.1％)。檢查中發(fā)生小腸穿孔和急性腸梗阻并發(fā)癥各1例，均經(jīng)及時處理而痊愈。 2．通過DNA測序及PCR-RFLP酶切驗證，有5例CD患者發(fā)現(xiàn)有P268S突變，其中3例為雜合子改變，2例為純合子改變，發(fā)生率為10.4％，其堿基有C變成T，密碼子有CCC變成UCC，編碼的氨基酸有脯氨酸變?yōu)榻z氨酸，而UC組和HC組沒有發(fā)現(xiàn)1例P268S突變，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher精確概

13、率檢驗P=0.003)，在對NOD2/CARDl5基因12個外顯子其他片段的測序中沒有發(fā)現(xiàn)新的突變位點。提示P268S可能是NOD2/CARDl5基因與中國人相關(guān)的突變位點。所有病例沒有發(fā)現(xiàn)1例有R702W，G908R及3020 insC三個常見于西方人的基因多態(tài)位點。 3．48例CD患者中，12例發(fā)病年齡小于20歲的患者中有4例發(fā)現(xiàn)P268S突變，36例發(fā)病年齡大于20歲的患者中只有1例發(fā)現(xiàn)P268S突變，按Fisher；精確

14、概率檢驗(下同)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.011)，說明P268S突變與CD患者的發(fā)病年齡明顯相關(guān)。36例男性患者中發(fā)現(xiàn)3例P268S突變，12例女性患者中發(fā)現(xiàn)2例P268S突變，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.587)，說明P268S與CD患者的性別無相關(guān)性。5例有P268S突變者病變部位均在回腸，而病變位于結(jié)腸及其他者未見1例P268S突變，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)，說明P268S突變與CD患者的發(fā)病

15、部位有明顯相關(guān)性，有P268S突變的CD患者病變部位主要在回腸。 4．經(jīng)克隆、酶切鑒定及基因測序證實成功獲得P268S突變型NOD2蛋白真核表達載體。各表達載體瞬時轉(zhuǎn)入人胚腎細胞48小時后，western Blot及RT-PCR分別驗證NOD2蛋白得到有效表達。P268S突變型與野生型NOD2蛋白的表達均能增強LPS刺激后HEK293T細胞中NF-KB的核內(nèi)移水平，但兩者之間的差別不明顯。 結(jié)論： 1．對克羅恩病

16、而言，雙氣囊內(nèi)鏡是安全、有效的診斷方法，特別在發(fā)現(xiàn)小腸的病灶方面，但僅靠潰瘍的形狀、數(shù)目(即使結(jié)合內(nèi)鏡組織活檢)，對克羅恩病的診斷也未必是特異的，及時行外科處理對某些潰瘍性病變的診斷和治療都是有益的。 2．P268S可能是NOD2/CARDl5基因與中國人CD發(fā)病明顯相關(guān)的SNP，而與UC無關(guān)。 3．除P268S外沒有發(fā)現(xiàn)新的突變位點。 4．我們的研究未發(fā)現(xiàn)R702W，G908R及3020 insC三個常見于西方

17、人CD的基因多態(tài)位點。 5．P268S與CD的發(fā)病年齡、病變部位及并發(fā)癥有關(guān)，而與患者的性別及病變嚴重程度無關(guān)。有P268S突變的患者發(fā)病年齡多小于20歲、病變部位多在回腸且容易出現(xiàn)腸腔狹窄并發(fā)腸梗阻而需手術(shù)治療。說明NOD2/CARD15基因可能是部分中國人CD發(fā)病的易感基因。 6．P268S突變型與野生型NOD2蛋白均能增強LPS刺激后HEK293T細胞中的NF-K B的活化水平，表明NOD2蛋白的表達可以促進293