不同類型的PRRSV GP5重組蛋白的表達(dá)及其抗體中和活性的分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductice and Respiratory Syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙和生長(zhǎng)期豬的呼吸道癥狀為特征的高度傳染性疾病，給世界范圍的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。中和抗體在抵抗PRRSV的感染中起到至關(guān)重要的作用，PRRSV的GP5蛋白作為病毒囊膜的重要組成部分，被認(rèn)為是誘導(dǎo)中和抗體的主要蛋白，也較多應(yīng)用于PRRSV基因工程疫苗

2、的研究。然而以GP5作為目標(biāo)基因的亞單位疫苗往往不能誘導(dǎo)較高滴度的中和抗體，并且交叉保護(hù)性較差，該蛋白在免疫保護(hù)中的地位目前也存在一定爭(zhēng)議。因此通過(guò)體外高效表達(dá)GP5蛋白，并分析其誘導(dǎo)中和抗體的能力，將為探討GP5在PRRSV免疫保護(hù)中的作用及其在PRRSV防控中的應(yīng)用提供一定理論參考。
　　實(shí)驗(yàn)一旨在以原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)缺失跨膜區(qū)和信號(hào)肽的截短GP5重組蛋白。本研究首先利用Marc-145細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)室所保存的PRRSV美洲株VR2

3、332進(jìn)行增殖，通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增出完整的ORF5基因，連接至PMD18-T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒PMD18T-ORF5并進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)ORF5基因的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其中一對(duì)引物用于擴(kuò)增ORF5基因上編碼N-端多肽的核酸片段(ORF5N)，另一對(duì)引物用于擴(kuò)增ORF5基因上編碼C-端多肽的核酸片段(ORF5C)，采用重疊延伸PCR技術(shù)(Gene sphcing by overlap extension PCR，SOE-PCR)對(duì)兩

4、個(gè)片段進(jìn)行連接，擴(kuò)增出缺失跨膜區(qū)(66aa-125aa)和信號(hào)肽(1aa-31aa)序列的ORF5基因片段并連接至原核表達(dá)載體PET-32a，構(gòu)建原核表達(dá)載體PET-ORF5NC。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)成功表達(dá)出大小為31.5KD的GP5重組蛋白，與預(yù)期的蛋白大小相符。經(jīng)過(guò)對(duì)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的濃度、時(shí)間的優(yōu)化，獲得了重組蛋白的高效表達(dá)，以尿素法純化包涵體蛋白并復(fù)性，分別以鼠抗His單克隆抗體和PRRSV陽(yáng)性血

5、清為一抗對(duì)重組蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示重組蛋白可以被鼠抗His單克隆體和PRRSV陽(yáng)性血清所識(shí)別，表明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。
　　實(shí)驗(yàn)二旨在以桿狀病毒/昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)全長(zhǎng)的GP5重組蛋白，并表達(dá)缺失跨膜區(qū)、信號(hào)肽的截短GP5重組蛋白。根據(jù)實(shí)驗(yàn)一所獲得的OFR5基因片段，再次設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其中一對(duì)引物以質(zhì)粒PMD18T-ORF5為模版，擴(kuò)增出完整的ORF5基因片段(ORF5);另一對(duì)引物以質(zhì)粒PET-O

6、RF5NC為模版，擴(kuò)增出缺失跨膜區(qū)、信號(hào)肽的ORF5基因片段(ORF5NC)，分別連接至pFastBac-HTA供體質(zhì)粒，將獲得的兩種重組供體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒穿梭質(zhì)粒的DH10-Bac細(xì)胞，經(jīng)三重抗性和藍(lán)白斑篩選，獲得兩種重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-ORF5和Bacmid-ORF5NC。將穿梭質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒AcMNPV-ORF5和AcMNPV-ORF5NC;將兩種重組桿狀病毒分別感染Sf9細(xì)胞，以SDS-

7、PAGE和Western blot對(duì)兩種重組桿狀病毒所表達(dá)的蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，Sf9細(xì)胞中分別表達(dá)了大小約為22KD的全長(zhǎng)的GP5重組蛋白和大小為17KD的截短的GP5重組蛋白，與預(yù)期的蛋白大小相符并均為非糖基化形式。大量表達(dá)重組蛋白，并以Ni柱親和層析方法對(duì)兩種重組蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)SDS-PAGE并以ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，目的蛋白純度均達(dá)到90％以上，其中AcMNPV-ORF5表達(dá)純化產(chǎn)物為903％，AcMNPV-ORF

8、5NC表達(dá)純化產(chǎn)物為92.6％。
　　實(shí)驗(yàn)三旨在探討所獲得的三種GP5重組蛋白誘導(dǎo)PRRSV中和抗體產(chǎn)生的能力。將三種重組蛋白作為免疫原，分別免疫昆明小鼠制備三種抗血清，并分別以各重組蛋白和PRRSV仝病毒作為ELISA包被抗原，檢測(cè)抗血清的效價(jià)。結(jié)果表明，當(dāng)以各重組蛋白作為ELISA包被抗原檢測(cè)自身對(duì)應(yīng)的抗血清時(shí)，抗原核表達(dá)的截短GP5蛋白抗血清效價(jià)為1∶25600，抗真核表達(dá)的全長(zhǎng)GP5蛋白抗血清效價(jià)為1∶12800，抗真核表

9、達(dá)的截短GP5蛋白抗血清效價(jià)為1∶12800;當(dāng)以PRRSV全病毒作為ELISA包被抗原檢測(cè)抗血清時(shí)，抗原核表達(dá)的截短GP5蛋白抗血清效價(jià)為1∶200，抗真核表達(dá)的全長(zhǎng)GP5蛋白血清效價(jià)為1.800，抗真核表達(dá)的截短的GP5蛋白血清效價(jià)為1∶1600。以本實(shí)驗(yàn)室已建立的中和試驗(yàn)方法將獲得的三種抗血清分別在豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)進(jìn)行PRRSV的血清學(xué)中和試驗(yàn)，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR