我國部分地區(qū)PRRSV的分子流行病學(xué)分析與NADC30-like株GP5蛋白的原核表達(dá).pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一種廣泛傳播且致病性較強(qiáng)的病毒性疾病，其特征是母豬繁殖障礙，不同年齡段豬群表現(xiàn)出呼吸系統(tǒng)癥狀，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于該病毒具有很高的變異性，為了解我國近兩年內(nèi)PRRS的流行狀況及變異特點(diǎn)，同時對流行毒株進(jìn)一步探索。本研究對我國部分地區(qū)PRRSV分子流行病學(xué)進(jìn)行分析，完成了流行毒株的毒株分離及GP5蛋白

2、的原核表達(dá)，主要內(nèi)容如下:
　　1.對2015～2016年收集自我國23個省份的發(fā)病豬場PRRS疑似病料進(jìn)行PRRSV病原檢測，并對部分具有代表性的陽性病料進(jìn)行ORF5基因的擴(kuò)增測序，得到了177個PRRSV ORF5基因序列。結(jié)果顯示，在3078份疑似病料中，共檢測出陽性樣本889份，陽性率為28.88％;對得到的ORF5基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，177個毒株均屬于美洲型毒株，其中90株與我國的HP-PRRSV亞群代表株JXA

3、1高度同源，34株與NADC30高度同源。與2015年相比，2016年我國PRRSV的流行仍以HP-PRRSV為主要流行毒株，NADC30-like毒株在流行毒株中的占比上升了12.04％。同時，PRRSV的流行不具有明顯的地域特性。對ORF5基因的推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示部分NADC30-like毒株在N34位糖基化位點(diǎn)存在缺失，提示有必要繼續(xù)進(jìn)行PRRSV的分子流行病學(xué)監(jiān)測，為下一步的防控提供依據(jù)。
　　2.將PRRS

4、V陽性組織病料進(jìn)研磨后接種到Marc-145細(xì)胞中，連續(xù)傳代進(jìn)行病毒分離，在傳至第3～4代時出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變。繼續(xù)傳代的同時，對其進(jìn)行RT-PCR鑒定和測定病毒效價，通過測序驗(yàn)證后確定分離到的3株病毒均為PRRS病毒，分別命名為JX1、JX2、SD1。毒株序列分析后顯示3株毒株均屬于NADC30-like毒株，對第5代病毒液的病毒效價進(jìn)行測定，結(jié)果顯示病毒含量分別為10-6 TCID50/0.1mL、10-5.33TCID50/0.1

5、mL、10-5.67TCID50/0.1mL。
　　3.對分離的一株P(guān)RRSV流行毒株(JX1)的GP5基因進(jìn)行擴(kuò)增，以GP5基因的重組質(zhì)粒載體為模板分別擴(kuò)增兩條片段，通過融合PCR得到缺失GP5信號肽和跨膜區(qū)的基因片段（dORF5），將其克隆到表達(dá)載體pGEX-6P-1上。將原核表達(dá)載體pGEX-6P-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用濃度為1 mmol/L的IPTG在37℃條件下誘導(dǎo)。SDS-PAGE電泳檢測，所表達(dá)蛋白的分子量約為3