軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞復(fù)合在藻酸鈣-RGD支架上共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)的目的是在體外探索RGD對(duì)軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響、種子細(xì)胞與生物材料貼附后的生物學(xué)特性變化和利用兩種細(xì)胞在體外混合共培的微環(huán)境對(duì)其生物學(xué)特性的影響，力求尋找RGD對(duì)細(xì)胞的最佳生物學(xué)效應(yīng)、細(xì)胞與生物材料之間的最佳整合、最佳仿生體內(nèi)的微環(huán)境和探索不同細(xì)胞間的相互影響。 方法：本研究分為4部分： 1．采用酶消化法可以獲得大量純度高的軟骨細(xì)胞，利用甲苯胺藍(lán)和番紅O對(duì)其鑒定。 2．軟骨細(xì)胞在不同濃度RGD的

2、刺激作用下的平面培養(yǎng)：動(dòng)態(tài)檢測培養(yǎng)P2軟骨細(xì)胞的增殖率和細(xì)胞外基質(zhì)的含量；動(dòng)態(tài)觀察P2軟骨細(xì)胞在不同濃度RGD的刺激下細(xì)胞的貼壁率和生長、增值及分化情況；采用MTT比色法對(duì)細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測。 3．采用翻轉(zhuǎn)干沽法來獲得純度高的成骨細(xì)胞，利用堿性磷酸酶對(duì)其進(jìn)行鑒定。 4．軟骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞以不同比例（1：2，1：1，2：1）混合在一起在不同濃度RGD刺激下的單層培養(yǎng)和在不同濃度RGD與藻酸鹽共價(jià)交聯(lián)的支架上復(fù)合共培養(yǎng)，在2

3、、4、6周動(dòng)態(tài)檢測混合培養(yǎng)的的軟骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞在單層和藻酸鹽/RGD環(huán)境下的生物學(xué)特性的變化的規(guī)律，采用消化計(jì)數(shù)法對(duì)比在藻酸鹽上共孵細(xì)胞增殖率和采用組織學(xué)及組織免疫學(xué)對(duì)比兩種細(xì)胞混合在一起在不同時(shí)間的生物學(xué)特征。 結(jié)果： 1、采用酶過夜和非過夜消化法可以獲取純度高、活性高的的軟骨細(xì)胞。 2、平面單層培養(yǎng)的二代軟骨細(xì)胞在不同濃度RGD的刺激下呈現(xiàn)具有不同的差異性，不同濃度組對(duì)軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響則表現(xiàn)不同．

4、無藥組、1ug/ml、2ug/ml組的軟骨細(xì)胞的貼壁率無明顯差異、對(duì)生長和細(xì)胞活性未見明顯影響，4ug/ml和8ug/ml組明顯增加軟骨細(xì)胞的貼壁率，4ug/ml組表現(xiàn)對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和活性無抑制作用，維持細(xì)胞的良好表型，但8ug/ml組對(duì)軟骨細(xì)胞增殖及活性具有抑制作用，并出細(xì)胞死亡的現(xiàn)象，細(xì)胞增殖和活性低于其他組。 3、采用組織塊翻轉(zhuǎn)干沽法來獲得細(xì)胞80％以上均是成骨細(xì)胞，純度高。 4、a、在rAC和rAO混合爬片培養(yǎng)時(shí)

5、，以2：1組混合培養(yǎng)時(shí)兩種細(xì)胞生長、增殖相當(dāng)，而1：2、1：1組中軟骨細(xì)胞表現(xiàn)生長緩慢、稀少，隨著時(shí)間的增加甚至難以發(fā)現(xiàn)，而成骨細(xì)胞數(shù)目占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢，生長、分泌活躍。b、藻酸鈉包裹的rAC和rAO混合培養(yǎng)組中，與藻酸鹽交聯(lián)的RGD4ug/ml組的兩種細(xì)胞生物學(xué)特性表現(xiàn)良好。4ug/ml組明顯高于陰性對(duì)照組和2ug/ml組，且較穩(wěn)定，支架材料未見明顯的降解，兩種細(xì)胞表型均具有較強(qiáng)的表達(dá)。而8ug/ml時(shí)使細(xì)胞粘附增殖快，但生物材料在2周時(shí)

6、開始出現(xiàn)崩裂、塌陷，導(dǎo)致后期細(xì)胞生長不佳，甚至發(fā)生死亡。陰性對(duì)照組與2ug/ml組無明顯差異。組織學(xué)表現(xiàn)：在爬片組中，Ⅱ型膠原和糖胺多糖的強(qiáng)度隨軟骨細(xì)胞的比例增加而增強(qiáng)，堿性磷酸酶表達(dá)強(qiáng)度隨其增加而減弱，2-4周逐漸增加，4-6周逐漸降低；同一比例組中陰性對(duì)照組與2ug/ml組Ⅱ型膠原和糖胺多糖表達(dá)的強(qiáng)度弱于4ugml組，8ug/ml組明顯比無藥組和2ug/ml組弱，陰性對(duì)照組和2ug/ml組之間無明顯的差異。在支架上培養(yǎng)時(shí)，在0——4

7、ug/ml組中Ⅱ型膠原表達(dá)的強(qiáng)度呈峰值變化，糖胺多糖與堿性磷酸酶的表達(dá)強(qiáng)度在2-4周逐漸增加，4-6周穩(wěn)定；4ug/ml組表達(dá)最強(qiáng)，陰性對(duì)照組和2ug/ml組之間差異不明顯；8ug/ml組的時(shí)間變化而逐漸減弱，在2周時(shí)高于陰性對(duì)照組和2ug/ml組，在4、6周時(shí)其強(qiáng)度時(shí)明顯地弱于其他組。 結(jié)論： 1、酶消化法是獲取軟骨細(xì)胞的一種可行性方法。 2、通過對(duì)單一軟骨細(xì)胞單層培養(yǎng)的研究，少量的RGD對(duì)軟骨細(xì)胞的貼壁、增殖

8、分化無明顯促進(jìn)作用，而高濃度的刺激雖可促進(jìn)貼壁，但抑制其生長、增殖、分化，適合的濃度能促進(jìn)軟骨細(xì)胞貼壁而對(duì)生長無明顯的抑制作用。 3、翻轉(zhuǎn)干沽法是獲取成骨細(xì)胞可行性的方法。 4、經(jīng)過軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞混合組在爬片培養(yǎng)和藻酸鹽三維支架上培養(yǎng)的研究，得出適合的比例有利于兩種細(xì)胞均勻的增殖、分化，具有成軟骨和成骨效應(yīng)；高濃度的RGD（8ug/ml）能使藻酸鹽生物材料加速降解，適合的濃度（4ug/ml）能促進(jìn)細(xì)胞貼壁、增殖。rA