生物衍生骨支架制備分析及其復合成骨細胞實驗研究.pdf

1、目的：
　　提取乳鼠顱骨來源的成骨細胞；制備生物衍生骨支架，分析其理化特性及生物相容性等；并復合成骨細胞體外三維培養(yǎng)，研究其對成骨細胞在細胞及分子水平上增殖與分化的影響。
　　材料與方法：
　　1、采用消化傳代法結(jié)合反復貼壁法，獲取SD乳鼠顱骨來源的成骨細胞作為種子細胞。
　　2、截取新鮮豬松質(zhì)骨，經(jīng)脫脂、脫蛋白、部分脫鈣及去抗原處理獲得生物衍生骨支架，并進行Micro-CT三維結(jié)構(gòu)分析、掃描電鏡形態(tài)觀察、紅外光

2、譜成分分析、急性毒性實驗、熱原性實驗、溶血實驗及皮內(nèi)刺激實驗等生物相容性檢測。
　　3、支架復合成骨細胞體外三維培養(yǎng)，研究其對成骨細胞在細胞增殖、堿性磷酸酶活性及Ⅰ型膠原、骨鈣素基因表達等分子水平上的影響。
　　結(jié)果：
　　1、提取的細胞在形態(tài)學及堿性磷酸酶染色和礦化結(jié)節(jié)染色均符合成骨細胞生物學特性。
　　2、經(jīng)脫脂、脫蛋白、部分脫鈣及去抗原處理獲得生物衍生骨支架，經(jīng)Micro-CT掃描分析孔隙率為79.52%，

3、空隙直徑在183μm~400μm之間。掃描電鏡示支架保留天然骨組織的網(wǎng)狀孔隙結(jié)構(gòu)，孔道間具有相互交錯的分布，孔徑大小為160μm~390μm，孔道內(nèi)壁平滑無附著物。紅外光譜分析示脫脂、脫蛋白效果良好，保留了支架的羥基磷灰石成分。支架的浸提液細胞毒性實驗示相同時間點實驗組與對照組間細胞增殖無顯著差異（p＜0.05）；實驗組細胞相對增殖率均在80%~99%之間，材料細胞毒性為1級，無明顯細胞毒性。熱原性實驗結(jié)果：每個時段實驗組和對照組各3只

4、家兔體溫升高＜0.6℃，體溫升高總度數(shù)＜1.4℃，生理鹽水浸提液未引起家兔急性毒性反應；紅細胞溶血率均小于0.5%；皮內(nèi)刺激實驗評分為0，即無皮內(nèi)刺激反應。
　　3、掃描電鏡顯示成骨細胞在支架上生長狀態(tài)良好；細胞活力在第1、3天和第13天時，實驗組及對照組間無統(tǒng)計學差異，在第5、7、9、11天時實驗組均高于對照組（p＜0.05）；堿性磷酸酶活性在第1、3、11天時，實驗組與對照組間無統(tǒng)計學差異；在第5、7、9天時實驗組均高于對照組

5、（p＜0.05）；COLⅠ的表達在第3、7天時，實驗組顯著高于對照組（p＜0.05）；OCN表達在第11天時，實驗組顯著高于對照組（p＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、通過消化傳代法結(jié)合反復貼壁法成功獲取成骨細胞。
　　2、經(jīng)物理化學等方法處理獲得生物衍生骨支架在三維結(jié)構(gòu)、組成成分及各項生物相容性指標等方面均符合骨組織工程對于支架的要求。
　　3、支架復合成骨細胞體外三維培養(yǎng)環(huán)境，生物衍生骨支架為細胞增殖提供廣