兔皮質(zhì)骨來源成骨細胞與三種支架材料的體外實驗研究.pdf

1、目的:對通過酶消化法獲取的兔尺骨皮質(zhì)骨細胞進行鑒定,探討其體外生長、增殖能力及理想的作為種子細胞的代數(shù);檢測兔皮質(zhì)骨成骨細胞在自制小牛脫蛋白松質(zhì)骨、凍干松質(zhì)骨(XKC-FDB系列同種骨)及可吸收性明膠海綿三種支架上的生長情況,對三種支架材料與兔皮質(zhì)骨成骨細胞的生物相容性進行評價,并用不同的細胞密度與三種支架材料復(fù)合培養(yǎng),探求合適的細胞接種密度。為骨組織工程的細胞來源、載體材料的選擇和進一步動物體內(nèi)試驗提供實驗依據(jù)。
　　 方法與

2、結(jié)果:
　　 第一章兔皮質(zhì)骨來源成骨細胞體外培養(yǎng)與鑒定的實驗研究
　　 從3月齡新西蘭大白兔(雌雄不限)獲取尺骨皮質(zhì)骨,通過酶消化法獲取原代細胞,適時傳代。每日倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)及增殖特征:MTT法檢測細胞生長和增殖情況,繪制生長曲線;檢測第2、3、6、7和8代細胞ALP:行ALP染色、I型膠原免疫組織化學(xué)染色及骨鈣素免疫組化染色,對細胞進行鑒定。結(jié)果:分離培養(yǎng)出的原代細胞,形態(tài)類似成纖維細胞,具有良好的體外增殖

3、能力,細胞倍增時間約為7天,各項染色檢測呈強陽性。細胞增殖速度:第1～2天,各代細胞無差別(P＞0.05),第3天開始第7、8代細胞落后于第2、3和6代細胞,一直持續(xù)到第10天(P＜0.05),而第2、3代同第6代細胞及第7代同第8代細胞之間無顯著性差異(P＞0.05)。ALP檢測:第2、3、6代成骨細胞高于第7、8代細胞(P＜0.05)。
　　 第二章兔皮質(zhì)骨來源成骨細胞與三種支架材料的復(fù)合培養(yǎng)
　　 將成骨細胞接種到

4、三種支架材料上,進行體外復(fù)合培養(yǎng),用倒置相差顯微鏡、掃描電鏡觀察細胞在支架材料上的生長、增殖情況,并進行MTT、細胞上架率、ALP及骨鈣素檢測。結(jié)果:倒置相差顯微鏡顯示三種支架為多孔網(wǎng)狀,孔隙互相通連,隨培養(yǎng)時間的延長,細胞生長旺盛,增殖迅速。掃描電鏡顯示復(fù)合培養(yǎng)3d時,有較多的細胞粘附并鋪展在支架上,培養(yǎng)6d時,細胞完全伸展,呈長梭形:10d時細胞分泌較多的細胞外基質(zhì),重疊生長并連接成網(wǎng)狀,尤以兩種骨性材料組明顯。MTT檢測顯示三種支

5、架材料在實驗前期不影響成骨細胞的生長、增殖(P＞0.05);后期(9d、12d)能促進成骨細胞的增殖及分泌,與對照組比較有顯著性差異(P＜0.05),而三種支架材料組之間無顯著性差異(P＞0.05)。細胞上架率:當(dāng)細胞接種密度為1×106/ml時,可吸收明膠海綿細胞上架率最高,為45.52±3.15％。ALP檢測,細胞密度為1×105/ml時各組之間無顯著性差異(P＞0.05),細胞密度為1×106/ml時三種支架材料組高于對照組(P＜

6、0.05),三種支架材料組之間無顯著性差異(P＞0.05),細胞密度為6×106/ml及1×107/ml時,可吸收明膠海綿組＞小牛脫蛋白松質(zhì)骨組＞凍干松質(zhì)骨組＞對照組(P＜0.05);在12d時細胞密度為6×106/ml的各組支架材料ALP＞細胞密度為1×107/ml的各組支架材料ALP。骨鈣素檢測:第14天小牛脫蛋白松質(zhì)骨組及凍干松質(zhì)骨組明顯高于對照組及可吸收明膠海綿組(P＜0.05):第21天及第28天,小牛脫蛋白松質(zhì)骨組＞凍干松質(zhì)

7、骨＞可吸收明膠海綿組＞對照組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、兔尺骨皮質(zhì)骨體外可以培養(yǎng)出成骨細胞,體外培養(yǎng)的成骨細胞具有增殖、分泌功能,其中第2、3、6代細胞增殖和分泌功能強于第7、8代細胞。新西蘭大白兔皮質(zhì)骨成骨細胞理想的作為種子細胞的代數(shù)為2-6代細胞。
　　 2、三種支架材料與兔皮質(zhì)骨成骨細胞理想細胞接種密度為1×106/m1～6×106/ml;隨細胞接種密度上升細胞上架率在下降,當(dāng)細胞接種密度為

8、1×106/ml時,可吸收明膠海綿細胞上架率最高,為45.52±3.15％。
　　 3、在理想接種密度下,ALP檢測,可吸收明膠海綿＞小牛脫蛋白松質(zhì)骨＞凍干松質(zhì)骨＞對照組;骨鈣素檢測,小牛脫蛋白松質(zhì)骨＞凍干松質(zhì)骨＞可吸收明膠海綿＞對照組。
　　 4、本實驗制備的小牛脫蛋白松質(zhì)骨與兔皮質(zhì)骨成骨細胞具有良好的生物相容性及骨誘導(dǎo)性,且制備方便,價格低廉,是很好的骨替代材料,把小牛脫蛋白松質(zhì)骨與兔皮質(zhì)骨成骨細胞復(fù)合構(gòu)建組織工程骨