前列腺素E-,1-對(duì)血吸蟲(chóng)病家兔肝臟纖維化形成影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:血吸蟲(chóng)病肝纖維化家免實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建 目的：建立穩(wěn)定的、類(lèi)似人類(lèi)肝臟纖維化自然病程的家兔血吸蟲(chóng)病肝纖維化模型，了解模型動(dòng)物肝纖維化形成過(guò)程，為干預(yù)性實(shí)驗(yàn)用藥的時(shí)機(jī)選擇和效果觀察提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：血吸蟲(chóng)尾蚴皮膚敷貼法感染家兔，分別于感染尾蚴后4wk、6wk、8wk、10wk、12wk、16wk、20wk、24wk采用苦味酸天狼星紅和免疫組織化學(xué)方法分別動(dòng)態(tài)觀察感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴后的中國(guó)大耳白兔肝臟Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠

2、原和纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)成分和含量變化，以及蟲(chóng)卵肉芽腫數(shù)量、面積和肝纖維化程度。 結(jié)果：病理證實(shí)家兔血吸蟲(chóng)感染成功率100％，有3只家兔在應(yīng)用左旋吡喹酮?dú)⑾x(chóng)前因急性血吸蟲(chóng)病死亡；完成觀察期的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟纖維化模型成功率100％。感染血吸蟲(chóng)尾蚴后6wk，肝臟有急性蟲(chóng)卵肉芽腫形成，第8wk肉芽腫達(dá)到高峰，大部分被吸收而變?yōu)榫哂性鲋承宰兓募俳Y(jié)核性蟲(chóng)卵肉芽腫并逐漸縮小。感染后20～24wk，家兔肝臟增大、呈現(xiàn)中

3、重度血吸蟲(chóng)病特有的干線(xiàn)型纖維化。血吸蟲(chóng)感染第8周后肝臟肉芽腫周?chē)阂?jiàn)少量Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維，零星地分布在擴(kuò)大的匯管區(qū)以及新生肉芽腫的周?chē)?。隨后，Ⅰ型和Ⅲ型纖維含量明顯進(jìn)行性增加，肝臟纖維化程度進(jìn)行性加重。Ⅰ型膠原纖維沉積的速度明顯快于Ⅲ型膠原。在纖維化形成過(guò)程中FN含量先于膠原蛋白緩慢增加，均勻分布于蟲(chóng)卵肉芽腫基質(zhì)和匯管區(qū)，走向與Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原相同。 結(jié)論：日本血吸蟲(chóng)尾蚴感染家兔形成肝纖維化模型成功地在動(dòng)物體內(nèi)再現(xiàn)了人類(lèi)血吸蟲(chóng)

4、病相似的疾病發(fā)病過(guò)程，模型動(dòng)物肝臟FN和Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原含量緩慢持續(xù)穩(wěn)定增加，為進(jìn)一步進(jìn)行藥物探討纖維化發(fā)病機(jī)制及抗肝纖維化治療奠定了基礎(chǔ)。 第二部分:前列腺素(PG)E1對(duì)肝臟星狀細(xì)胞活化影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討血吸蟲(chóng)病家兔肝纖維化形成過(guò)程中，靜脈應(yīng)用前列腺素E1對(duì)肝臟星狀細(xì)胞(Hepaticstellatecells，HSCs)活化的影響以及過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ(Peroxisomeproliferato

5、rs-activatedreceptorgamma，PPARγ)在其中的作用。 方法：血吸蟲(chóng)尾蚴皮膚敷貼法感染家兔，構(gòu)建肝臟纖維化模型，其中7只家兔在感染后60d開(kāi)始給予PGE1(2.5μg.kg-1d-1)。至24wk透射電鏡比較HSCs超微結(jié)構(gòu)變化，免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝竇周?chē)交〖?dòng)蛋白(alphasmoothmuscleactin，α-SMA)表達(dá)，RT-PCR分別檢測(cè)HSCs活化表達(dá)Ⅰ型膠原前體α2(procollage

6、nⅠα2)mRNA和PPARγmRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：健康家兔肝臟高水平表達(dá)PPARγmRNA(OD.，18.53±5.27)。血吸蟲(chóng)病家兔肝臟纖維化形成過(guò)程中HSCs活化增加，收縮特性相關(guān)的α-SMA表達(dá)增強(qiáng)(強(qiáng)陽(yáng)性視野數(shù)34)，procollagenⅠα2mRNA表達(dá)增加(OD.，27.47±5.20)，而PPARγmRNA表達(dá)水平明顯降低。外源性PGE1可以抑制HSCs活化，顯著降低α-SMA(強(qiáng)陽(yáng)性視野數(shù)5)和proc

7、ollagenⅠα2mRNA(OD.，13.16±7.86)表達(dá)(P＜0.01)；PGE1干預(yù)能促進(jìn)PPARγmRNA水平上升(OD.，9.89±2.16)，與對(duì)照組(OD.，3.45±1.21)比較，P＜0.05。 結(jié)論：HSCs活化是血吸蟲(chóng)病家兔肝纖維化形成的重要環(huán)節(jié)。PGE1可以有效地抑制抑制HSCs活化，這種作用至少部分地是通過(guò)增強(qiáng)PPARγ表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。 第三部分:前列腺素(PG)E1對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)代謝影響的實(shí)驗(yàn)研

8、究 目的：探討前列腺素E1對(duì)血吸蟲(chóng)病家兔肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix，ECM)基因表達(dá)、成熟和降解的影響。 方法：血吸蟲(chóng)尾蚴皮膚敷貼法感染14只家兔，其中7只家兔于感染后60d開(kāi)始靜脈應(yīng)用PGE1(2.5μg/kg·d-1)至24wk。RT-PCR方法檢測(cè)肝組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原，MMP1、MMP13，TIMP1以及HSP47基因mRNA表達(dá)水平；苦味酸天狼星紅染色，偏振光顯微鏡觀察Ⅰ、Ⅲ型成熟

9、膠原含量；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)纖維連接素(Fibronectin，F(xiàn)N)表達(dá)。 結(jié)果：與健康家兔比較，血吸蟲(chóng)病家兔肝纖維化形成過(guò)程中Ⅰ、Ⅲ型膠原基因表達(dá)水平(OD.，3.92±3.66和3.17±0.32)和成熟纖維含量(面積比：49.25±9.71和9.66±3.59)均明顯增加；FN表達(dá)水平增加10余倍(OD.，43.41±14.62，P＜0.01)；HSP47mRNA表達(dá)增加6倍(OD.，0.43±0.07，P＜0.05)

10、。MMP1(OD.，0.41±0.14)、MMP13(OD.，0.37±0.20)，TIMP1(OD.，0.72±0.15)mRAN表達(dá)水平同向升高。外源性PGE1可以顯著降低膠原Ⅰ、ⅢmRNA(OD.，5.79±1.26和5.34±1.08，與對(duì)照組比較P＜0.01)和成熟纖維含量(面積比：13.38±4.24和6.23±8.92，與對(duì)照比較P＜0.01)；FN表達(dá)顯著降低(OD.，4.19±3.26，與對(duì)照組比較，P＜0.01)。P

11、GE1可以顯著抑制分子伴侶HSP47mRNA表達(dá)(OD.，0.12±0.02，與對(duì)照組比較，P＜0.05)。PGE1在抑制TIMP1mRAN(OD.，0.28±0.13)表達(dá)的同時(shí)，刺激增強(qiáng)MMP1mRNA(OD.，0.94±0.25)、MMP13(OD.，0.87±0.38)mRNA表達(dá)(P＜0.01)。 結(jié)論：PGE1可以通過(guò)下調(diào)Ⅰ、Ⅲ型膠原基因、HSP47基因表達(dá)水平，降低TIMP1基因并促進(jìn)MMP1、MMP13基因表達(dá)，

12、在基因表達(dá)、成熟和降解等多環(huán)節(jié)減少ECM沉積。 第四部分:前列腺素(PG)E1對(duì)細(xì)胞因子及其受體表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討肝臟纖維化形成過(guò)程中細(xì)胞因子及其受體表達(dá)的變化，以及外源性前列腺素E1(PGE1)對(duì)其表達(dá)的影響。 方法：血吸蟲(chóng)尾蚴皮膚敷貼法感染家兔，構(gòu)建14只肝臟纖維化模型，其中7只家兔在感染后60d開(kāi)始給予PGE1(2.5μg/kg.d-1)至24wk。RT-PCR檢測(cè)PDGF-BmRNA、TGF-

13、β1mRNA，原位雜交方法標(biāo)記IFN-γmRNA表達(dá)，免疫組織化學(xué)方法半定量了解TNF-α表達(dá)情況，同時(shí)westernblotting方法測(cè)定肝臟組織中PDGFR-β、TβR-Ⅰ表達(dá)水平。 結(jié)果：血吸蟲(chóng)病纖維化形成過(guò)程中，除纖維化保護(hù)性細(xì)胞因子IFN-γmRNA水平下降外，PDGFBmRNA(OD.，0.81±0.27)，TGF-β1mRNA(OD.，0.77±0.14)及其相應(yīng)受體PDGFR-β(OD.，0.46±0.07)、

14、TβR-Ⅰ(OD.，0.63±0.28)蛋白水平均顯著升高(P＜0.01)，TNF-α蛋白表達(dá)(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：52.31±16.18)亦增高明顯。外源性PGE1治療后PDGFBmRNA(OD.，0.39±0.15)，TGF-β1mRNA(OD.，0.21±0.83)及其相應(yīng)受體PDGFR-β(OD.，0.21±0.11)、TβR-Ⅰ(OD.，0.16±0.09)蛋白水平增高趨勢(shì)都受到明顯遏制(P＜0.01)，兩種受體水平分別較對(duì)照組下降7